Characterization of CAMTA1 and Nkx2.2 in the context of glioblastoma cancer stem cell biology Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Biologie und Vorklinische Medizin der Universität Regensburg vorgelegt von Ludwig Wankerl aus Regensburg im Jahr 2015 II Das Promotionsgesuch wurde eingereicht am: 03. Juli 2015 Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. rer. nat. Gunter Meister Unterschrift: III Our greatest weakness lies in giving up. The most certain way to succeed is always to try just one more time. Thomas A. Edison IV V Abstract Glioblastoma multiforme (glioblastoma) is the most malignant type of tumor in the human brain. For glioblastomas and several other cancer types, the existence of so called "cancer stem cells" was described. Cancer stem cells are characterized by stem cell-like traits such as the capacity of self-renewal and differentiation. Moreover, there is evidence that these cells contribute to cancer recurrence after therapy. Several molecular-pathological factors are crucial for the emergence of glioblastomas in general and for glioblastoma cancer stem cells in particular. For example, certain microRNAs (miRNAs) such as the miRNA pair miR-9/9* are specifically enriched in glioblastoma cancer stem cells. This miRNA pair acts as oncogene for glioblastomas by repressing the tumor suppressor Calmodulin-binding transcription activator 1 (CAMTA1). In this thesis, the upstream and downstream pathways of the CAMTA1 transcription factor were investigated in terms of their relevance in cancer biology. Therefore, siRNAs and antibodies against CAMTA1 were generated and established. Beyond that, a potential interaction partner of CAMTA1, Nkx2.2, was identified. Nkx2.2 is an important transcription factor for neural development and is also a potential tumor suppressor for glioblastomas. The tumor-suppressive effect of Nkx2.2 reported previously was further confirmed by this thesis. In this regard, it was shown that an overexpression of Nkx2.2 affected glioblastoma cancer stem cells negatively and impaired the proliferation of glioma cells. Additionally, a positive correlation between Nkx2.2 expression and survival of glioma patients was revealed. Furthermore, it was hypothesized that Nkx2.2 and CAMTA1 act in concert to stimulate the transcription of NPPA, which encodes for the precursor of the natriuretic VI – Abstract peptide (ANP). This activation was thought to be the main mechanism for these two transcription factors to cause their tumor-suppressive effects. Consistently, it was shown that an overexpression of Nkx2.2 elevated the NPPA mRNA levels and that Nkx2.2 can strongly induce the NPPA promoter. Nkx2.2 was further characterized in terms of additional interaction partners and a potential regulation by miRNAs. The findings of this thesis allow to postulate a model which describes a possible regulatory network important for understanding glioblastomas, in particular the formation and traits of glioblastoma cancer stem cells. This will advance therapy strategies that "tackle" these persistent cells. VII Zusammenfassung Glioblastoma multiforme (Glioblastom) ist eine Tumorform, die im Gehirn auftritt und unter den Gehirntumoren den höchsten Grad an Malignität aufweist. Für Glioblastome und diverse andere Krebsarten wurde die Existenz von sog. "Krebs-Stammzellen" nachgewiesen. Krebs-Stammzellen zeichnen sich durch ähnliche Charakteristika aus wie Stammzellen von normalem, gesundem Gewebe, d.h. sie sind fähig, sich zu differenzieren und selbst zu erneuern. Verschiedene molekular-pathologische Faktoren tragen zur Entstehung von Glioblastomen bzw. deren Krebs-Stammzellen bei. So sind beispielsweise bestimmte mikroRNAs (miRNAs) wie das bifunktionelle miRNA-Paar miR-9/9* vermehrt in diesen Krebs-Stammzellen exprimiert. Dieses spezielle miRNA-Paar reprimiert den Tumorsuppressor Calmodulin-binding transcription activator 1 (CAMTA1) und wirkt dadurch onkogen für Glioblastome. In dieser Arbeit sollte das zelluläre Netzwerk von CAMTA1, durch welches die tumor- suppressive Wirkung hervorgerufen wird, näher untersucht werden. Dazu wurden siRNAs und Antikörper gegen CAMTA1 generiert und auf ihre Funktionalität überprüft. Darüber hinaus konnte der Transkriptionsfaktor Nkx2.2 als ein potentieller Interaktionspartner von CAMTA1 identifiziert werden. Nkx2.2 spielt bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems eine wichtige Rolle und gilt ebenfalls als potentieller Tumorsuppressor für Glioblastome. Diese tumor-suppressive Wirkung von Nkx2.2 wurde in einer früheren Studie gezeigt und konnte durch diese Arbeit bestätigt werden: Eine Überexpression von Nkx2.2 beeinflusste Glioblastom-Krebs-Stammzellen negativ und verminderte deutlich die Proliferation von Glioma-Zellen. Zudem konnte VIII – Zusammenfassung ein Zusammenhang zwischen einer erhöhter Nkx2.2-Expression und einer höheren Überlebensrate von Patienten mit Gliomen festgestellt werden. In dieser Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass CAMTA1 und Nkx2.2 miteinander interagieren, um die Transkription des Gens NPPA zu steigern. NPPA kodiert für den Vorläufer des atrialen natriuretischen Peptids (ANP). Die Aktivierung des NPPA-Gens stellt vermutlich einen zentralen Mechanismus dar, über den die beiden Transkriptionsfaktoren CAMTA1 und Nkx2.2 ihre tumor-suppressive Wirkung vermitteln. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von Nkx2.2 tatsächlich zu einer Erhöhung der NPPA-Expression führte und dass Nkx2.2 in der Lage ist, den Promotor dieses Gens zu aktivieren. Ferner wurde untersucht, ob für Nkx2.2 weitere potentielle Interaktionspartner identifiziert werden können und ob Nkx2.2 durch miRNAs reguliert wird. Mit den in dieser Arbeit erbrachten Ergebnissen lässt sich ein Modell entwerfen, wie die Entstehung von Glioblastoma multiforme und dessen Krebsstam-Zellen durch einen Regulationsmechanismus potentiell unterdrückt wird. Dieses Modell kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen für die Entstehung von Glioblastomen, insbesondere von deren Krebs-Stammzellen, besser zu verstehen. Dadurch lassen sich möglicherweise neue Therapieansätze entwickeln. IX Contents Abstract .......................................................................................................................... V Zusammenfassung ....................................................................................................... VII Contents .......................................................................................................................IX List of Figures ............................................................................................................ XIV List of Tables ............................................................................................................. XVI List of Abbreviations ................................................................................................ XVII 1. Introduction ................................................................................................................ 1 1.1. Cancer stem cells .................................................................................................. 1 1.2. Glioblastoma multiforme ........................................................................................ 3 1.3. The role of microRNAs in glioblastoma biology .................................................. 7 1.3.1. miRNA biogenesis and miRNA-directed transcript regulation .................... 7 1.3.2. Several miRNAs are important for glioblastoma progression and glioblastoma cancer stem cell maintenance ............................................................. 8 1.4. The Calmodulin-binding transcription activator 1 is a tumor suppressor for glioblastomas ............................................................................................................. 11 1.4.1. The CAMTA family of transcription factors: Protein organization ............ 11 1.4.2. Function of CAMTA proteins from plants to mammals ............................ 14 1.4.3. CAMTA1 acts as tumor suppressor in neural tumors ................................. 16 1.5. Nkx2.2: A glioblastoma tumor suppressor candidate ......................................... 19 X – Contents 1.5.1. The Nkx protein family: Transcription factors essential for development ... 19 1.5.2. Nkx2.2 is important for neural development and a potential tumor suppressor protein .................................................................................................. 21 1.6. Aims and working model for this thesis ............................................................. 24 2. Results ....................................................................................................................... 27 2.1. Characterization of CAMTA1 ........................................................................... 27 2.1.1. Establishing of efficient CAMTA1 knockdown strategies .......................... 27 2.1.2. Polyclonal antibodies against CAMTA1 ..................................................... 29 2.1.3. Localization of CAMTA1 ........................................................................... 37 2.1.4. A potential CAMTA1 interaction partner: Nkx2.2 .................................... 44 2.2. Characterization of Nkx2.2 ................................................................................ 50 2.2.1. Nuclear localization of Nkx2.2 .................................................................... 50 2.2.2. Nkx2.2 interaction partners ........................................................................