UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR METARHIZIUM ANISOPLIAE: EXPRESSÃO DE PROTEÍNA TÓXICA DE ORIGEM VEGETAL E ANÁLISE GENÔMICA DE QUITINASES DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ÂNGELA JUNGES Porto Alegre, 2010 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR METARHIZIUM ANISOPLIAE: EXPRESSÃO DE PROTEÍNA TÓXICA DE ORIGEM VEGETAL E ANÁLISE GENÔMICA DE QUITINASES Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre ÂNGELA JUNGES DR. AUGUSTO SCHRANK , orientador DRA . CÉLIA REGINA CARLINI , co-orientadora DRA . MARILENE HENNING VAINSTEIN , co-orientadora Porto Alegre, abril de 2010. | i Este trabalho foi desenvolvido no LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR DE FUNGOS FILAMENTOSOS , no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. O sequenciamento do genoma de M. anisopliae foi realizado no Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC. O auxílio financeiro foi obtido da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES. | ii BANCA EXAMINADORA Dra. Maristela Pereira Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular Universidade Federal de Goiás Dr. Juliano Tomazzoni Boldo Laboratório de Biologia Celular e Molecular de Fungos Filamentosos Centro de Biotecnologia da UFRGS Dra. Fernanda Stanisçuaski Laboratório de Proteínas Tóxicas Centro de Biotecnologia da UFRGS Dra. Irene Silveira Schrank Membro Suplente da Banca Examinadora Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia Centro de Biotecnologia da UFRGS | iii DEDICATÓRIA AO VITOR E À MINHA FAMÍLIA | iv AGRADECIMENTOS Agradeço sinceramente as pessoas que contribuíram com o desenvolvimento deste trabalho, especialmente: Ao Dr. Augusto Schrank, pelas oportunidades e confiança depositadas na minha capacidade e pelos conhecimentos transmitidos que tanto contribuíram para o meu crescimento profissional e pessoal. À Dra. Marilene Henning Vainstein, por me receber nos laboratórios desde a Iniciação Científica, pelas oportunidades de aprendizado e pela confiança depositada. À Dra. Célia Regina Ribeiro Carlini, pelo apoio e atenção durante o desenvolvimento deste projeto. Ao Dr Charley Christian Staats e ao Dr. Juliano Tomazzoni Boldo, que foram meus mestres durante esta trajetória. À Comissão de Acompanhamento, composta pelos profs. Charley C. Staats e Maria Helena Pelegrinelli Fungaro, pela supervisão durante a execução do projeto. Aos integrantes da banca, Dra. Maristela Pereira, Dr. Juliano Tomazzoni Boldo e Dra. Fernanda Stanisçuaski pelas correções e valiosas sugestões. À Ana Tereza Ribeiro Vasconcelos, Marisa Fabiana Nicolás, Rangel Celso Souza e Luis Gonzaga Paula de Almeida, integrantes do Laboratório Nacional de Computação Científica. À Anne Helene Martinelli e ao Laboratório de Proteínas Tóxicas, pela sua ajuda durante a execução do projeto. Aos meus colegas de laboratório pelo carinho e amizade que tornaram os dias de dedicação em dias muito mais prazerosos e divertidos: Juliano, Lis, Bárbara, Juliana Beringer, Broetto, Juli, Mel, Caru, Lívia, Charley e Virgínia. As minhas queridas amigas Mel, Juli, Caru e Lis, por todos os momentos felizes. | v SUMÁRIO Lista de Abreviaturas, Símbolos e Unidades..................................................................viii Lista de Tabelas...................................................................................................................x Lista de Figuras...................................................................................................................xi Resumo...............................................................................................................................xiii Abstract...............................................................................................................................xv 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1 1.1. METARHIZIUM ANISOPLIAE: Características Gerais ................................................ 4 1.2. Biocontrole por Fungos Filamentosos .................................................................... 7 1.3. Mecanismo de Infecção e Fatores de Virulência .................................................. 11 2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 23 3. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................ 25 3.1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 25 3.1.1. Potencialização do Biocontrole por Entomopatógenos ..................................... 25 3.1.2. Peptídeo Entomotóxico Jaburetox-2Ec .............................................................. 28 3.2. OBJETIVO ............................................................................................................ 30 3.3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 30 3.3.1. Material Biológico ............................................................................................. 30 3.3.2. Meios de Cultivo e Manutenção dos Organismos .............................................. 31 3.3.3. Manipulação de Ácidos Nucléicos...................................................................... 31 3.3.4. Soluções e Enzimas Utilizadas ........................................................................... 32 3.3.5. Construção de pPZP::JAB::BAR para Agrotransformação .............................. 32 3.3.6. Agrotransformação de M. anisopliae e Confirmação da Inserção dos Cassettes ............................................................................................................................. 33 3.3.7. Análise da Expressão de Jaburetox-2Ec por M. anisopliae .............................. 34 3.3.8. Isolamento do Promotor e do Peptídeo Sinal contidos no Gene da Trealase Ácida de M. anisopliae ....................................................................................... 34 | vi 3.3.9. Análise Bioinformática da Trealase Ácida......................................................... 35 3.3.10. Construção de Vetores para Estudos de Regulação pelo Promotor da Trealase Ácida.................................................................................................................... 36 3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 37 3.4.1. Construção do Vetor Expressando a Proteína Entomotóxica Jaburetox-2Ec ... 37 3.4.2. Seleção de Transformantes de M. anisopliae .................................................... 39 3.4.3. Análise da Expressão de Jaburetox-2Ec por Western de Fração Intracelular . 41 3.4.4. Isolamento da Sequência da Trealase Ácida de M. anisopliae.......................... 44 3.5. PERSPECTIVAS .................................................................................................. 59 4. CAPÍTULO 2 ................................................................................................................ 60 4.1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 60 4.1.1. Quitinases de Fungos ......................................................................................... 60 4.1.2. Quitinases de M. anisopliae ............................................................................... 66 4.2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 68 4.3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 68 4.3.1. Biomineração por Quitinases no Genoma de M. anisopliae ............................. 68 4.3.2. Análise das Sequências de Quitinases Obtidas .................................................. 69 4.3.3. Análises Filogenéticas das Quitinases ............................................................... 69 4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 70 4.4.1. Biomineração por Quitinases no Genoma de M. anisopliae ............................. 70 4.4.2. Classificação das Quitinases ............................................................................. 73 4.4.3. Propriedades das Quitinases de M. anisopliae .................................................. 77 4.4.4. Análises Filogenéticas das Quitinases ............................................................... 88 4.5. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 97 5. DISCUSSÃO GERAL ................................................................................................... 98 6. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 102 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 103 | vii ANEXOS Anexo 1 . Árvore filogenética das quitinases de M. anisopliae .................................. 121 Anexo 2. Região central do alinhamento entre as quitinases preditas de M. anisopliae ...................................................................................................................