Luciana Lima Diversidade morfológica, biológica e genética, e relações filogenéticas de tripanossomas de morcegos do Brasil e Moçambique (África) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Ciências. São Paulo 2011 Luciana Lima Diversidade morfológica, biológica e genética, e relações filogenéticas de tripanossomas de morcegos do Brasil e Moçambique (África) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria Geraldes Teixeira São Paulo 2011 DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo reprodução não autorizada pelo autor Lima, Luciana. Diversidade morfológica, biológica e genética, e relações filogenéticas de tripanossomas de morcegos do Brasil e Moçambique (África). / Luciana Lima. -- São Paulo, 2011. Orientador: Marta Maria Geraldes Teixeira. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro. Linha de pesquisa: Biologia e filogenia de tripanossomatídeos. Versão do título para o inglês: Morphological, biological and genetic diversity, and phylogenetic relationships of bat trypanosomes from Brazil and Mozambique (Africa) Descritores: 1. Trypanosoma 2. Morcegos 3. Filogenia 4. Catepsina L 5. Schizotrypanum 6. Taxonomia I. Teixeira, Marta Maria Geraldes II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro III. Título. ICB/SBIB067/2011 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ______________________________________________________________________________________________________________ Candidato(a): Luciana Lima. Título da Tese: Diversidade morfológica, biológica e genética, e relações filogenéticas de tripanossomas de morcegos do Brasil e Moçambique (África). Orientador(a): Marta Maria Geraldes Teixeira. A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a) Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Marta Maria Geraldes Teixeira pela oportunidade, incentivo e exemplo de profissionalismo. Ao Prof. Dr. Erney Camargo pelo estímulo e colaboração dados a este trabalho. À Marta Campaner pelos ensinamentos iniciais e pela dedicação no isolamento e manutenção dos parasitas utilizados neste estudo. À Carmen Takata pelo auxílio constante no laboratório e grande ajuda na parte da morfologia deste trabalho. À Profa. Gentilda K. Funayama Takeda por todo apoio prestado no meu ingresso ao laboratório. Ao Prof. Dr. Fernando Paiva (UFMS) pela colaboração nas coletas do Pantanal. Aos Profs: Dr. Luis Neves (Universidade Eduardo Mondlane – Maputo) e Carlos L. Pereira (Parque Nacional da Gorongosa) pela colaboração nas coletas em Moçambique. Aos colaboradores: Dra. Vânia L.B. Nunes (UNIDERP), Dra. Ângela C.V. Junqueira (FIOCRUZ) pelas amostras cedidas. Ao prof. Dr. Valdir Tadei (in memoriam) e Dra Caroline Cotrin Aires (Museu de Zoologia da USP) pela identificação dos morcegos brasileiros. Aos amigos que já saíram do laboratório e aos que continuam – em especial à Flávia, que contribuiu diretamente em meu trabalho. A todos os docentes e funcionários do Departamento de Parasitologia (ICB/USP). Aos meus amigos do departamento. A todos meu muito Obrigado. Tente mover o mundo – o primeiro passo será mover a si mesmo. Platão Este trabalho contou com apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Cordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). PREFÁCIO “Esta tese foi elaborada de acordo as normas da CPG / ICB relativas a outras formas de elaboração de tese de doutorado que permite a inclusão, como Anexos, de resultados já publicados ou submetidos em periódicos internacionais indexados em língua inglesa. Permite ainda que detalhes metodológicos e resultados obtidos sejam aqueles contidos nos artigos anexados ao corpo da tese”. Artigos que compõem o corpo da tese: Anexo 1- Phylogeographical, ecological and biological patterns shown by nuclear (ssrRNA and gGAPDH) and mitochondrial (Cyt b) genes of trypanosomes of the subgenus Schizotrypanum parasitic in Brazilian bats Anexo 2- A new genotype of Trypanosoma cruzi associated with bats evidenced by phylogenetic analyses using SSU rRNA, cytochrome b and Histone H2B genes and genotyping based on ITS1 rDNA Anexo 3- A Trypanosoma cruzi-like new species from African bats (Chiroptera: Molossidae) supported by morphological, developmental and multigene phylogenetic analyses Anexo 4- Trypanosoma rangeli isolates of bats from Central Brazil: genotyping and phylogenetic analysis enable description of a new lineage using spliced-leader gene sequences Anexo 5- A new trypanosome species infecting African bats (Rhinolophidae and Hipposideridae): taxonomic appraisal based on morphological and behavioral features and phylogenetic inferences using SSU rRNA and gGAPDH genes Anexo 6- Genes of cathepsin L-like proteases in Trypanosoma rangeli isolates: Markers for diagnosis, genotyping and phylogenetic relationships Anexo 7- Repertoire diversity, evolutionary relationships and genomic organization of cruzipain encoding genes in phylogenetic diverse Trypanosoma cruzi isolates and homologues from closely related T. c. marinkellei and T. dionisii RESUMO Lima L. Diversidade morfológica, biológica e genética, e relações filogenéticas de tripanossomas de morcegos do Brasil e Moçambique (África). Tese de Doutorado. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. Apesar de conhecido, há mais de 100 anos, que os morcegos albergam uma grande variedade de tripanossomas dos subgêneros Schizotrypanum, Megatrypanum e Herpetosoma, nosso conhecimento sobre a diversidade genética, variedade de hospedeiros e de vetores, ciclos de vida, distribuição e relações filogenéticas é restrito a poucas espécies de Schizotrypanum. A maioria dos tripanossomas de morcegos foi classificada exclusivamente com base em morfologia. A comparação de padrões eco-geográficos de tripanossomas e de morcegos permite avaliar possíveis cenários que expliquem a diversidade, relações filogenéticas e distribuição atual dos tripanossomas de morcegos. Nessa tese, a diversidade genética e padrões filogeográficos de tripanossomas de morcegos brasileiros foi avaliada pelo exame de 1.043 morcegos, de 63 espécies pertencentes a 7 famílias, da Amazônia, Pantanal, Cerrado e Mata Atlântica. A prevalência de morcegos infectados por tripanossomas foi de 12,9% por hemocultura, resultando em 77 culturas. A maioria das culturas foi morfológica- e molecularmente identificada como Schizotrypanum spp. As análises filogenéticas dos genes SSUrRNA, gGAPDH e Cytb revelaram três clados, T. dionisii, T. c. marinkellei e T. cruzi, que juntos formam o clado Schizotrypanum. T. dionisii (32,4%) foi encontrado em morcegos pertencentes a 4 famílias, em todos os biomas; T. c. marinkellei (49,3%) apenas em filostomídeos da Amazônia e Pantanal. T. cruzi (18,2%) pricipalmente em morcegos vespertilionídeos e filostomídeos do Pantanal/Cerrado e da Mata Atlântica, com poucos isolados da Amazônia. Os clados de tripanossomas de morcegos foram relacionados com os vetores, história evolutiva, ecologia e filogeografia dos morcegos.