UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA UNAN-LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS y TECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA “Edgar Munguía Álvarez” Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Autor: Bra. Lucía Páiz Medina Tesis para optar al título de Licenciada en Biología TUTORA: Verónica Díaz Vargas Ph.D Asesor: Prof. Jorge Huete-Pérez Ph.D León, Junio 2011 Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI “Nada tiene sentido en Biología si no es a la luz de la Evolución” Theodosius Dobzhansky "No es el más fuerte de las especies el que sobrevive, tampoco es el más inteligente el que sobrevive. Es aquel que es más adaptable al cambio.” Charles Darwin Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Dedicatoria A la juventud científica nicaragüense, porque si se puede investigar en nuestro país. A los científicos que han dedicado su vida a investigar la ictiofauna de Nicaragua, a pesar de las dificultades. A Lucía Medina. Al Centro de Biología Molecular. Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Agradecimientos Al Dr. Jorge Huete, por su apoyo incondicional y ser un ejemplo a seguir, por ser inspiración para la vida científica y por haber hecho posible esta investigación. A la Dra. Verónica Díaz, por su apoyo y asesoría, por acompañarme en este largo camino y no dejarme desistir, y por ser ejemplo de mujer investigadora y docente. A Matthias Geiger, Jeffrey McCrary y Lorenzo López, por su ayuda en la colección de muestras y compartir sus conocimientos. A Carlos, Julio, Raquel, Yasica, Inti y Ana, mis colegas del Centro de Biología Molecular, por su invaluable apoyo y por animarme en los momentos difíciles. A mis profesores del Departamento de Biología, por ser un ejemplo a seguir y formarme no solo a nivel profesional, sino también personal, especialmente a: Prof. Verónica Díaz, Vilma Solís, Lourdes Callejas, y Rolando Martínez quienes dejaron una huella en mi vida. A mi mamá, Lucía Medina, por ser el ejemplo de justicia, perseverancia y responsabilidad. A Luis Carlos Chávez, por su apoyo incondicional y por darme ánimos siempre. A New England Biolabs y Centro de Biología Molecuar-UCA por apoyar con el financiamiento de esta investigación. Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Resumen En Nicaragua existe un grupo de peces que habitan lagos y lagunas cratéricas, pertenecientes a la familia Cichlidae, que desde los primeros intentos de clasificación han sido objeto de discusión, debido a que algunos son muy parecidos morfológicamente y no fue posible diferenciarlos y clasificarlos. Es necesario comprender las relaciones filogenéticas y las causas posibles del proceso de especiación de estas especies para su conservación. En este estudio se utilizó como marcador el gen COI (Citocromo C oxidasa subunidad I) para determinar las relaciones filogenéticas entre los peces del Complejo. Los peces se colectaron en lagos y lagunas cratéricas utilizando redes de agalla o arpón. El ADN se extrajo de tejido de la aleta pectoral, utilizando protocolo de extracción orgánica y un kit comercial. Para la PCR se utilizaron dos enzimas: Taq polimerasa y Phire® Hot Start II. La secuenciación se llevo a cabo en un analizador genético ABI 3130 y para realizar el análisis de las secuencias y árboles filogenéticos se utilizó el programa MEGA-5b. Se colectaron un total de 239 muestras en las siguientes localidades: Apoyo, Xiloá, Apoyeque, Asososca León, Monte Galán, Tiscapa, Moyúa, Lago de Nicaragua, Lago de Managua y Río San Juan. Se secuenciaron 70 muestras en las que se incluyó a todas las localidades y se elaboraron 4 árboles filogenéticos, en los que se presentan las relaciones entres los peces de lagos y lagunas. Con los árboles se concluye principalmente que: el gen COI discrimina entre especies de diferentes lagunas, se confirma que las relaciones entre las especies Midas Cichlidae son complejas y es necesario más de un gen para obtener resultados concluyentes, las especies fundadoras de las lagunas cratéricas provienen del lago de Nicaragua, en las lagunas habitan más de una especie del Complejo Midas Cichlidae y se infiere que la especiación simpátrica es el mecanismo evolutivo que ha conducido a la creación de estas especies. Esta tesis se enmarca dentro de una Investigación que se realiza en el Centro de Biología Molecular de la Universidad Centroamericana y se logró además, la creación de un proyecto en línea, en la Base de Datos del Código de barras de la vida, que contiene secuencias, imágenes e información taxonómica sobre las especies del Complejo. Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Índice I. Introducción…………………………………………………………………………1 II. Objetivos……………………………………………………………………………..3 III. Marco Teórico……………………………………………………………………….4 3.1 Biodiversidad……………………………………………………………………….4 3.2 Origen de los grandes lagos……………………………………………………..5 3.3 Peces de las Lagunas……………………………………………………………..7 3.4 Familia Cichlidae………………………………………………………………….11 3.4.1 Descripción morfológica 3.4.2 Reproducción 3.4.3 Alimentación 3.4.4 Importancia 3.4.5 Clasificación taxonómica 3.5 Complejo Midas Cichlidae………………………………………………………13 3.6 Especiación……………………………………………………………………......23 3.7 Marcadores Moleculares………………………………………………………...27 3.8 Código de Barras genético (DNA Barcoding)………………………………28 3.9 Técnicas Biología Molecular……………………………………………………31 3.9.1 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). 3.9.2 Secuenciación 3.9.3 Alineamiento de secuencias 3.9.4 Elaboración de los árboles filogenéticos IV. Materiales y Métodos……………………………………………………………..38 4.1 Recolección de Muestras……………………………………………………….38 4.2 Análisis de laboratorio…………………………………………………………..40 4.2.1 Extracción de ADN 4.2.2 Amplificación por PCR 4.2.3 Secuenciación 4.3 Análisis de las secuencias……………………………………………………...43 4.3.1 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 4.3.2 Edición y alineamiento de las secuencias 4.3.3 Elaboración de los árboles filogenéticos V. Resultados y Análisis…………………………………………………………….46 5.1 Recolección de muestras……………………………………………………….46 5.2 Extracción de ADN……………………………………………………………….46 5.3 Amplificación por PCR…………………………………………………………..47 5.4 Secuenciación…………………………………………………………………….48 5.5 Análisis de las secuencias del gen COI……………………………………..48 5.5.1 BLAST. 5.5.2 Alineamientos. 5.5.3 Elaboración de árboles filogenéticos. VI. Conclusiones………………………………………………………………………62 VII. Recomendaciones………………………………………………………………...64 VIII. Bibliografía…………………………………………………………………………65 IX. Anexos………………………………………………………………………………71 Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Lista de Tablas, Cuadros y fotografías Cuadro1. Especies de peces endémicas en Nicaragua…………………………..…4 Cuadro 2. Historia Natural y características biológicas de los lagos y lagunas cratéricas de Nicaragua dónde habitan especies del Complejo Midas Cichlidae……………………………………………………………………………………..9 Tabla 2. No de secuencias por localidad…………………………………………..…43 Tabla 1. Muestras colectadas en Lagos y Lagunas de Nicaragua…………………………………………………………..………46 Foto 1. Gel de agarosa 0.8 % teñido con bromuro de etidio, ADN genómico aislado de tejido de aleta pectoral…………………………………………..…………47 Foto 2. Gel de agarosa 1.4 % teñido con bromuro de etidio, Amplificación gen COI………………………………………………………………………………………..….47 Lista de Figuras Figura 1. Amphilophus citrinellus………………………………………………...……13 Figura 2. Amphilophus labiatus……………………………………………………..…14 Figura 3. Amphilophus zaliosus…………………………………………………..……15 Figura 4. Amphilophus amarillo………………………………………………………..16 Figura 5. Amphilophus xiloaensis……………………………………………………..17 Figura 6. Amphilophus sagittae……………………………………………………..…18 Figura 7. Amphilophus chancho ………………………………………………………19 Figura 8. Amphilophus flaveolus …………………………………………………...…20 Figura 9. Amphilophus astorquii ………………………………………………………21 Figura 10. Amphilophus supercilius………………………………………..…………22 Figura 11. Amphilophus globosus……………………………………………………..23 1 Filogenética Molecular de Peces del Complejo Midas Cichlidae que habitan lagos y lagunas de Nicaragua utilizando el gen COI Figura 12. A. Lagunas muestreadas B. Sitios muestreados en el Lago de Nicaragua, Managua y Río San Juan. ……………………………………...39 Figura 13. BLAST de secuencia para conocer si se estaba secuenciando el segmento adecuado de COI………………………………………………………..…...49 Figura 14. Alineamiento de las secuencias utilizando el programa MEGA-5b , algoritmo ClustalW…………………………………………50 Figura 15. Árbol Neighbor-Joining basado en el gen Citocromo C oxidasa subunidad I (región mitocondrial)……………………………………………………..54 Figura 16. Árbol Neighbor-Joining de las lagunas Xiloá y Apoyo basado en el gen Citocromo C oxidasa sub unidad I (región mitocondrial)………………………………………………………………………….……56 Figura 17. Árbol Neighbor-Joining de las lagunas Monte Galán, Tiscapa, Apoyeque, Asososca León y Lago de Managua basado en el gen Citocromo C oxidasa sub unidad I (región mitocondrial)……………………………………….…58 Figura 18. Árbol Neighbor-Joining del Lago de Nicaragua y Río San Juan basado en el gen Citocromo C oxidasa sub unidad I (región mitocondrial)…………………………………………………………………………….…60 Figura 19. Ejemplo de una página del Proyecto “DNA Barcode