1. Tartalomjegyzék 1. TARTALOMJEGYZÉK 1 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2 3. BEVEZETÉS 3 4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 5 4.1. SZIKES TAVAK 5 4.2. NÁD ÉS NÁDAS 9 4.3. NÖVÉNY-ASSZOCIÁLT BIOFILMEK 12 4.4. SZIKES TAVAK MIKROBIÁLIS DIVERZITÁSA 15 5. CÉLKITŰZÉSEK 23 6. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 24 6.1. MINTAVÉTEL 24 6.2. BAKTÉRIUMKÖZÖSSÉGEK SZÉNFORRÁS HASZNOSÍTÁSON ALAPULÓ FENOTÍPUSOS UJJLENYOMATA 26 6.3. TENYÉSZTÉSEN ALAPULÓ VIZSGÁLATOK 27 6.3.1. CSÍRASZÁMBECSLÉS ÉS BAKTÉRIUMTÖRZSEK IZOLÁLÁSA 27 6.3.2. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK FENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 29 6.3.3. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK GENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 31 6.3.4. TENYÉSZTÉSTŐL FÜGGETLEN KÖZÖSSÉGI DNS IZOLÁLÁSON ALAPULÓ MÓDSZEREK 35 7. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 43 7.1. A VELENCEI-TAVI NÁD BIOFILM VIZSGÁLATOK 43 7.1.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 43 7.1.2. DGGE VIZSGÁLATOK 52 7.1.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 54 7.1.4. A KLÓNOZÁS EREDMÉNYEI 69 7.2. A KELEMEN-SZÉK ÉS A NAGY-VADAS NÁD BIOFILM VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 75 7.2.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 75 7.2.2. DGGE VIZSGÁLATOK 79 7.2.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 81 7.2.4. KLÓNKÖNYVTÁRAK VIZSGÁLATA 98 8. ÖSSZEFOGLALÁS 106 9. KIVONAT 113 10. ABSTRACT 115 11. FELHASZNÁLT IRODALOM 117 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 133 13. FÜGGELÉK 134 1 2. Rövidítések jegyzéke Általános rövidítések DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis TGGE Temperature Gradient Gel Electorphoresis ARDRA Amplified Ribosomal DNS Restriction Analysis TRFLP Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism PCR Polimerase Chain Reaction PCA Principal Component Analysis PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria EPS exopoliszacharid MPN Most Propable Number SRB Sulfate Reducing Bacteria CFU Colony forming unit Egyéb rövidítések O/F médium Hugh-Leifson oxidatív-fermentatív glükóz-hasznosítási médium TSY Trypticase soy yeast agar BLAST Basic Local Alignment and Search Tool IPTG izopropyl-béta-D-thiogalactopyranozid X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galacto-pyranozid PAA poliakrilamid APS Ammónium-perszulfát TEMED N,N,N',N'-tetrametil-etilén-diamin Velencei-tavi mintavételek, 2000. április és 2001. július FTK, FTB Fürdető belső és külső nádasállományból izolált törzs GTK, GTB Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs LTK, LTB Lángi-tisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs FNE, FNA Fürdető egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs GNE, GNA Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs LNE, LNA Lángi-tisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs Velencei-tavi mintavételek, 2003 és 2006 FB Fürdető, biofilm minta GB Agárd-Gárdony Hosszútisztás, biofilm minta LB Lángi-tisztás, biofilm minta Alföldi szikes tavak mintavételei, 2004. április, 2005-2006 KB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta VB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta 2 3. Bevezetés A szigorúan védett szikes élőhelyek Magyarországon jelentős természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai és zoológiai sajátságaiknak köszönhetően. A nagy nyíltvízi felülettel és állandó vízborítottsággal jellemezhető Fertő és ” Velencei-tó mellett különleges szikes környezetek a kiskunsági „székek , melyek igen sekély, nyár végén gyakran teljesen kiszáradó, alkalikus és enyhén sós vízterek. Hazánk másik nagy kiterjedésű szikes térsége a Tiszántúlon található, melynek sekély vizű szikes tavait viszonylag magas ionkoncentráció, lúgosság, sófelhalmozódás, nagyfokú egyedi és szezonális változatosság jellemzi. A nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel) Európa és Magyarország különböző tájainak flóraleíró munkáiban közönséges fajként szerepel. Nagy kiterjedésben megtalálható nagy tavaink (a Balaton, a Fertő, a Velencei-tó) és az alföldi szikes tavak parti régiójában. A tó és tágabb környezete életében a nádasok egyrészt víztisztító funkciójuk, másrészt trofikus kapcsolatokban játszott szerepük miatt nagyon jelentősek. Az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén a nádasok környezetének megismerését célzó mikrobiológiai kutatások elsőként a Fertő és a Velencei-tó esetében kezdődtek meg. Ezek a vizsgálatok elsősorban a nádnövénnyel kapcsolatban álló aerob és anaerob baktériumközösségek faji összetételét és anyagcsere aktivitását vizsgálták. Az alföldi szikes vízterek esetében eddig csak az üledék aerob baktériumközösségek feltérképezése történt meg. A nádszárak víz alatti részén kialakuló biofilmek aerob baktériumközösségeinek faji struktúrájára, a nádnövénnyel kialakított lehetséges szerepére vonatkozó ismereteink azonban meglehetősen szórványosak. A nád biofilm szerkezetének és működésének ismerete az adott víztérben azért lényeges, mert felépítése és összetétele alapján jól elkülöníthetők a környezettanilag különböző élőhelyek, minőségének és mennyiségének alakulása pedig a vízminőségi állapotot, illetve annak megváltozását tükrözi. Természetes környezetekben betöltött szerepének ismerete nagyon fontos lehet a szennyvízkezelési célból létesített mesterséges vizes élőhelyek mikrobiológiai folyamatainak optimalizálásában, hatékonyságának növelésében. Munkánk során a Velencei-tó és az alföldi Kelemen-szék és Nagy-Vadas nád biofilm felépítésében résztvevő baktériumközösségek faji összetételének feltérképezését és a közösségi anyagcsere mintázat megismerését tűztük ki célul, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerek alkalmazásával. 3 4. Irodalmi áttekintés 4.1 Szikes tavak A szárazföldek felszínének 1/15-ét borító vizes élőhelyek adnak otthont a legdiverzebb élővilágnak, különösen a mérsékelt éghajlati övezetben. A felszíni vizek hidrológiai tulajdonságaik alapján állóvizekre és vízfolyásokra oszthatók. Az állóvizek morfometriájuk alapján lehetnek mély- és sekély vízterek, valamint vizes élőhelyek (wetlands). A sekély vízterekre és a vizes élőhelyekre a litorális régió meghatározó aránya a jellemző a pelágikussal szemben (Lakatos és mtsai, 1998). A sekély vízterek és vizes élőhelyek különleges csoportját alkotják a sós vizek, melyen belül vízkémiai tulajdonságaik alapján elkülönülő egységet képeznek az alkalikus kémhatású szikes vizek. A Föld minden lakott kontinensén találunk elszórtan (gyakran szélsőségesen kontinentális viszonyok között kialakuló) sós, szikes tavakat, melyek becsült víztérfogata (104000 km3 – 125000 km3) megközelíti az édesvizekét (Boros, 1999). A sós tavak lehetnek tengeri eredetűek, vagy tengertől független, athalasszohalin kialakulásúak, neutrális, enyhén savas vagy lúgos kémhatásúak. Az athalasszohalin kialakulású, alkalikus sós tavakat nevezik szikes vizeknek. E víztestek közös jellemzője, hogy 2- meghatározó anionjuk a CO3 és komplexei. A karbonát ionok eredetére vonatkozóan sok teória látott már napvilágot, melyek közül ma a legelfogadottabb, hogy a szikes tavak alapkőzete nagy mennyiségű Na2CO3-ot tartalmaz, ami a talajvíz kimosódása révén a tavak + - 2- medencéjében akkumulálódik. A vízben így a Na és a HCO3 /CO3 -ionok disszociált állapotban tartanak egyensúlyt, lúgos hidrolízisük okozza az alkalikus kémhatást. Mivel a - 2- 2+ 2+ HCO3 /CO3 -ionok koncentrációja jóval meghaladja a Ca és a Mg -ionokét, így azok csak kis mértékben képesek a karbonátot sóként kicsapni. Nagy Ca2+ koncentráció esetén neutrális sós tavak keletkeznek, pl. Nagy Sós-tó (USA). Ha a Ca2+ mellett jelentős mennyiségű Mg2+ is jelen van enyhén savanyú sós tavak (pl. Holt-tenger) keletkeznek (Grant, 1992). A szikes tómedrek jellemzője a felszíni lefolyás hiánya, aminek következménye, hogy a nagyarányú párolgás miatt vizükben sófelhalmozódás mehet végbe. A lefolyástalan medencék kialakulása általában komplex folyamat eredménye, melyben szerepet játszhat a vulkáni működés (pl. a törökországi Van-tó), a tektonikus mozgás (pl. a Kelet-afrikai árokrendszer tavai, az egyiptomi nátron tavak izolációja a Nílustól), valamint a szél és a 4 folyók medencealakító tevékenysége (pl. kiskunsági és tiszántúli szikes tavak) is (Grant, 1992; Duckworth és mtsai, 1996; Tamásné, 1999). A Föld szikes tavai közül legintenzívebben a Kelet-afrikai árokrendszer tavait, a kaliforniai Mono-tavat és a közép-ázsiai szikes tavakat vizsgálták. A tektonikusan aktív Kelet- afrikai árokrendszer tavai (pl. az Elementeita, a Magadi és a Natron-tó) Ca2+-ban és Mg2+-ban szegény, Na+-ban gazdag vulkáni kőzetek mélyedéseiben alakultak ki (Baker és mtsai, 1971). Észak-Amerika legismertebb szóda tava a Mono-tó (Kalifornia), mely szintén vulkanikus + - 2- 2- eredetű mélyedésben jött létre, vizét a Na , Cl , CO3 és SO4 ionok sói, valamint jelentős 3- + mennyiségű BO3 és K ion jellemzi, erősen alkalikus (pH 10) kémhatású (Humayoun és mtsai, 2003). Az ázsiai szikes tavak közül a transz-bajkáli, a mongóliai (Baer-tó) és a szibériai tavakat kutatták részletesen (Sorokin és mtsai, 2003; Ma és mtsai, 2004). Európában a kifejezetten kontinentális jellegű szikes vizek a keleti területekre korlátozódnak, melyek legnyugatibb tagjai a Kárpát-medencében találhatók. Jelentős részük áldozatul esett a belvízrendezési, csatornázási és mezőgazdasági tájátalakító (meliorációs) tevékenységeknek. A megmaradt szikes élőhelyek Európa-szerte kiemelkedő jelentőségű természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai, zoológiai tulajdonságaiknak köszönhetően. Megőrzésük érdekében 1996-ban minden hazai természetközeli állapotban fennmaradt szikes tavat országos jelentőségű védett területnek nyilvánítottak (Boros, 1999). A Kárpát-medence két legnagyobb sekély szikes víztere a Fertő és a Velencei-tó, számos szikes vizes élőhely található azonban