Molekularbiologische Untersuchung der Diversität von Mikroorganismen in gefluteten und ungefluteten Pappelmikrokosmen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Andrea Graff aus Stade Marburg / Lahn 2005 Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von November 2000 bis November 2005 am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in Marburg/ Lahn unter der Leitung von Prof. Dr. Ralf Conrad durchgeführt. Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: 09. November 2005 Erstgutachter: Prof. Dr. R. Conrad Zweitgutachter: Prof. Dr. E. Bremer Tag der Disputation:16. Dezember 2005 Ein Großteil der in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse ist in der folgenden Publikation veröffentlicht: Graff, A. und R. Conrad. 2005. Impact of flooding on soil bacterial communities associated with poplar (Populus sp.) trees. FEMS Microbiol. Ecol. 53:401-415. „Es ist des Lernens kein Ende“. Robert Schumann Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGEN................................................................................................................ 1 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................... 3 I. EINLEITUNG ............................................................................................................... 5 1. Boden und Pappelpflanze als mikrobieller Lebensraum........................................... 5 2. Mikrobielle Diversität ................................................................................................... 8 3. Molekularbiologische Methoden zur Charakterisierung eines Habitats ............... 11 4. Ziele der Arbeit............................................................................................................ 13 II. MATERIAL UND METHODEN............................................................................... 14 1. Materialien ................................................................................................................... 14 1.1. Chemikalien und Gase......................................................................................... 14 1.2. Bodenmaterial und Pappelpflanzen..................................................................... 15 1.2.1. Boden........................................................................................................... 15 1.2.2. Herstellung der Pappelmikrokosmen........................................................... 16 1.2.3. Definition der Habitate und Probennahme .................................................. 17 2. Inkubationsexperiment............................................................................................... 19 2.1. Ansatz der Bodenaufschlämmungen ................................................................... 19 2.2. Probenentnahme für chemische und physikalische Analysen............................. 19 2.2.1. Gasproben.................................................................................................... 19 2.2.2. Flüssigproben .............................................................................................. 19 3. Chemische und physikalische Methoden .................................................................. 20 3.1. Gaschromatographische Analysen ...................................................................... 20 3.1.1. Messung von Methan und Kohlendioxid .................................................... 20 3.1.2. Messung von Wasserstoff............................................................................ 20 3.2. Berechnungen ...................................................................................................... 21 3.3. Analyse organischer Säuren und Alkohole ......................................................... 22 3.4. Analyse anorganischer Ionen............................................................................... 23 3.5. Kolorimetrische Bestimmung von Eisen (II) ...................................................... 24 3.6. Bestimmung des pH-Wertes................................................................................ 24 3.7. Bestimmung des C/N-Gehaltes ........................................................................... 25 Inhaltsverzeichnis 3.8. Bestimmung des Trockengewichts...................................................................... 25 4. Molekularbiologische Methoden................................................................................ 26 4.1. Extraktion von DNA............................................................................................ 26 4.1.1. Extraktion von Umwelt-DNA aus Boden und Pflanzenmaterial................. 26 4.1.2. Extraktion von DNA aus E.coli–Klonen ..................................................... 28 4.2. Reinigung der Umwelt-DNA von Huminsäuren................................................. 28 4.3. Agarosegelelektrophorese ................................................................................... 30 4.4. Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen ............................................... 31 4.5. PCR (Polymerase Chain Reaction – Polymerase Kettenreaktion) ...................... 31 4.5.1. Primer .......................................................................................................... 31 4.5.2. Amplifikation der 16S rDNA ...................................................................... 32 4.6. Terminale-Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus-Analyse (T-RFLP-Analyse)............................................................................................... 35 4.6.1. Restriktion der 16S rDNA-Amplifikate ...................................................... 35 4.6.2. Elektrophorese............................................................................................. 36 4.6.3. Auswertung der T-RFLP-Analyse............................................................... 37 4.7. Erstellung von 16S rDNA–Klonbibliotheken ..................................................... 38 4.8. Sequenzanalyse der klonierten 16S rDNA-Fragmente........................................ 40 4.8.1. Sequenzierreaktion ...................................................................................... 40 4.8.2. Reinigung der Sequenzierreaktions-Produkte ............................................. 42 4.8.3. Analyse der Sequenzierreaktions-Produkte................................................. 42 4.9. Phylogenetische Analyse..................................................................................... 44 4.9.1. Sequenzverarbeitung ................................................................................... 44 4.9.2. Phylogenetische Einordnung der partiellen und der vollständigen 16S rRNA-Gensequenzen ........................................................................... 44 5. Statistische Methoden ................................................................................................. 46 5.1. Abschätzung des Artenreichtums ........................................................................ 46 5.2. Statistische Auswertung der T-RFLP-Ergebnisse ............................................... 47 III. ERGEBNISSE ............................................................................................................. 49 1. Molekulare Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften in gefluteten und ungefluteten Pappelmikrokosmen...................................................................... 49 1.1. T-RFLP-Analyse der bakteriellen Lebensgemeinschaften.................................. 49 Inhaltsverzeichnis 1.2. Phylogenetische Identifikation einzelner bakterieller Gruppen .......................... 54 1.3. Abschätzung des bakteriellen Artenreichtums .................................................... 62 1.4. Struktur und phylogenetische Diversität der Archaea......................................... 63 2. Inkubationsexperiment aus Pappelmikrokosmen und feldfrischen Bodenproben70 2.1. Zeitlicher Verlauf geochemischer Parameter in Bodenaufschlämmungen ......... 70 2.1.1. Elekronenakzeptor-Konzentrationen........................................................... 70 2.1.2. Methan, Kohlendioxid und Wasserstoff...................................................... 71 2.1.3. Organische Säuren und pH-Wert................................................................. 73 2.2. Mikrobielle Gemeinschaften der Bodenaufschlämmungen ................................ 75 2.2.1. Struktur und phylogenetische Diversität der Bacteria ................................ 75 2.2.2. Struktur und phylogenetische Diversität der Archaea................................. 82 IV. DISKUSSION .............................................................................................................. 89 1. Pappel und Boden als mikrobieller Lebensraum ..................................................... 89 2. Biogeochemische Prozesse in Bodenaufschlämmungen........................................... 91 3. Bakterielle Diversität .................................................................................................. 94 3.1. Bodenaufschlämmungen ..................................................................................... 94 3.2. Pappelmikrokosmen ............................................................................................ 97 4. Archaeelle Diversität in Bodenaufschlämmungen und Pappelmikrokosmen ..... 104 5.