Molekulare Kardiologie Klinik für Innere Medizin III mit den Schwerpunkten Kardiologie, Angiologie und internistische Intensivmedizin Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel Direktor: Prof. Dr. med. Norbert Frey Die Rolle des herzspezifischen Proteins CEFIP in der kardialen Hypertrophie und Kardiomyopathie Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von Franziska Dierck Kiel, 2018 Molekulare Kardiologie Klinik für Innere Medizin III mit den Schwerpunkten Kardiologie, Angiologie und internistische Intensivmedizin Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel Direktor: Prof. Dr. med. Norbert Frey Die Rolle des herzspezifischen Proteins CEFIP in der kardialen Hypertrophie und Kardiomyopathie Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von Franziska Dierck Kiel, 2018 Erster Gutachter: Prof. Dr. Norbert Frey Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Bernd Clement Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2018 Zum Druck genehmigt:10.07.2018 gez.: (Dekanin) Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................... 1 I Abbildungsverzeichnis ..................................................................................... 3 II Tabellenverzeichnis .......................................................................................... 5 III Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 7 IV Zusammenfassung ......................................................................................... 11 V Abstract ........................................................................................................... 13 1 Einleitung ......................................................................................................... 15 1.1 Kardiomyopathien ........................................................................................................................ 15 1.2 Kardiale Hypertrophie .................................................................................................................. 18 1.3 Die Z-Scheibe .............................................................................................................................. 24 1.4 Screening für unbekannte Z-Scheibenproteine ........................................................................... 27 1.4.1 Fbxl22 .................................................................................................................................... 27 1.4.2 CEFIP ..................................................................................................................................... 27 1.5 Zielsetzung der Arbeit .................................................................................................................. 30 2 Material und Methoden ................................................................................... 31 2.1 Materialien ................................................................................................................................... 31 2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial ............................................................................................. 31 2.1.2 Chemikalien ........................................................................................................................... 32 2.1.3 Enzyme .................................................................................................................................. 34 2.1.4 Kits ......................................................................................................................................... 35 2.1.5 Oligonukleotide und Primer .................................................................................................... 36 2.1.6 Adenovirale Konstrukte .......................................................................................................... 40 2.1.7 Vektoren und Plasmide .......................................................................................................... 40 2.1.8 Silencer® siRNA .................................................................................................................... 41 2.1.9 Antikörper ............................................................................................................................... 41 2.1.10 Puffer und Lösungen .............................................................................................................. 42 2.1.11 Medien ................................................................................................................................... 43 2.1.12 Zelllinien ................................................................................................................................. 44 2.1.13 Bakterien ................................................................................................................................ 45 2.1.14 Versuchstiere ......................................................................................................................... 45 2.2 Methoden ..................................................................................................................................... 45 2.2.1 Mikrobiologische Methoden ................................................................................................... 45 2.2.2 Zellkulturmethoden................................................................................................................. 47 2.2.3 Molekularbiologische und biochemische Methoden .............................................................. 50 2.2.4 Tierversuche .......................................................................................................................... 64 2.2.5 Statistische Auswertung ......................................................................................................... 67 1 Inhaltsverzeichnis 3 Ergebnisse ...................................................................................................... 69 3.1 Systematische Suche nach unbekannten kardialen Genen und deren Bestätigung .................. 69 3.1.1 CEFIP ist ein herz- und skelettmuskel-spezifisches Protein ................................................. 69 3.2 Die Untersuchung des kardialen CEFIP in der pathologischen Hypertrophie ............................ 74 3.2.1 CEFIP ist in in vivo Modellen der Hypertrophie reguliert ....................................................... 74 3.2.2 Humane DCM-Proben zeigen erhöhte CEFIP Spiegel ......................................................... 75 3.3 Einfluss von CEFIP auf die Hypertrophie in vitro ........................................................................ 76 3.3.1 Adenovirale CEFIP-Überexpression führt zu Hypertrophie ................................................... 76 3.3.2 CEFIP ist ein hochdynamisches Protein ............................................................................... 78 3.4 CEFIP interagiert mit FHL2 und induziert eine Calcineurin abhängige Hypertrophie ................. 80 3.4.1 CEFIP aktiviert den Calcineurin-NFAT Signalweg in NRVCMs ............................................ 81 3.4.2 „Knockdown“ von CEFIP blockiert den Calcineurin-NFAT Signalweg in NRVCMs .............. 82 3.4.3 Die Induktion der NFAT-Luciferase-Aktivität durch CEFIP ist nicht FHL2-abhängig ............ 84 3.4.4 CEFIP reguliert nicht den SRF-Signalweg ............................................................................ 85 3.4.5 CEFIP besitzt zwei Phosphorylierungsstellen ....................................................................... 86 3.5 Charakterisierung CEFIP-defizienter Mäuse ............................................................................... 88 3.5.1 CEFIP-Knockout Mäuse weisen erhöhte Spiegel bekannter Hypertrophiemarker auf ......... 89 3.5.2 Auch einjährige CEFIP-defiziente Tiere zeigen keinen kardialen Phänotyp ......................... 93 3.6 Einfluss verschiedener Hypertrophie-Stimuli auf CEFIP-defiziente Tiere ................................... 95 3.6.1 CEFIP-Knockout Mäuse entwickeln unter Konstriktion der Aorta transversa eine kardiale Dysfunktion .............................................................................................................. 96 3.6.2 Stimulation mit Isoproterenol führt bei CEFIP-Knockout Mäusen zur Vergrößerung des Herzens................................................................................................................................ 100 3.6.3 Die Calcineurin-induzierte Hypertrophie wird durch CEFIP-Defizienz nicht verstärkt ......... 104 3.7 Bestätigung des CEFIP-Einflusses in isolierten neonatalen Mauskardiomyozyten .................. 110 4 Diskussion .................................................................................................... 113 4.1 CEFIP ist ein neues Z-Scheibenprotein .................................................................................... 113 4.2 Funktionelle Einordnung von CEFIP ......................................................................................... 114 4.3 Abhängigkeit der Hypertrophieinduktion von CEFIP ................................................................. 115 4.4 Rolle von CEFIP in Kardiomyopathien .....................................................................................