Háskólinn á Akureyri Viðskipta- og raunvísindasvið - Líftækni Námskeið LOK1126 og LOK1226 Heiti verkefnis Characterization of cathelicidin gene family members in Rock Ptarmigan (Lagopus muta) Verktími Janúar – maí 2017 Nemandi Hallgrímur Steinsson Leiðbeinandi Kristinn Pétur Magnússon Upplag Rafrænt auk þriggja prentaðra eintaka Blaðsíðufjöldi 53 Fjöldi viðauka 1 Fylgigögn Engin Útgáfu- og notkunarréttur Opið verkefni Yfirlýsingar „Ég lýsi því yfir að ég einn er höfundur þessa verkefnis og að það er afrakstur eigin rannsókna“ _________________________________ Hallgrímur Steinsson, 210878-5649 „Það staðfestist að verkefni þetta fullnægir að mínum dómi kröfum til prófs í námskeiðunum LOK1126 og LOK1226“ __________________________________ Kristinn P. Magnússon, leiðbeinandi ii Abstract Cathelicidins are a class of antimicrobial peptides expressed in vertebrate species which are part of the innate immune system. The aim of this thesis was to resolve genomic organization of the cathelicidin gene cluster in rock ptarmigan (Lagopus muta) and to predict the amino sequence of the mature peptides and analyze expression. To locate the cathelicidin genes the chicken (Gallus gallus) genome sequences were used to blast a novel draft genome of rock ptarmigan. The draft genome was subsequently used to design primers for PCR and sequencing, to enable obtaining the entire cathelicidin cluster. The characterization of the cathelicidin cluster in rock ptarmigan revealed all four cathelicidin genes orthologues found in chicken and turkey (Meleagris gallopavo), namely CATHL1, CATH2, CATH3, CATHB1, flanked by KLH18 and TBRG4, in the same order on chromosome 2. The genes map to a 15kb region, which is of similar size in chicken. The quality of the region is good except for two minor gaps of ~100bp. The sequence harbored the exons coding for the mature peptide for all four cathelicidin genes. Analysis by RT-qPCR revealed that all cathelicidins were expressed, using RNA isolated from eight tissues. Translation of the open reading frames of the cathelicidins revealed substitution in all four genes in rock ptarmigan. CATHL1, CATH2, CATH3 showing greatest similarity to chicken but CATHB1 to turkey. Keywords: Antibacterial peptides, genomics, RNA, PCR, RT-qPCR. iii Þakkarorð Við leiðarlok er við hæfi að staldra við og þakka þeim sem réttu hjálparhönd, veittu hvatningu og innblástur til að leggja mikla vinnu á sig á fullorðinsaldri við að sækja þekkingu og víkka sjóndeildarhring sinn. Það er mikið lán fyrir mig að hafa alist upp í fjölskyldu þar sem í sífellu er verið að deila hvert með öðru áhugaverðum hlutum og sækja nýjan fróðleik um ólíka hluti. Mér er minnisstætt að um ári áður en ég sótti um í Háskólann á Akureyri benti Jón bróðir minn mér á grein um samlífisbakteríur okkar sem varð kveikjan að enn frekari lestri um líffræði, meðal annars The Red Queen eftir Matt Ridley. Þegar ég ákvað eftir langa bið að láta loks af náminu verða valdi ég líftækni fram yfir sjávarútvegsfræði sem hefði legið beint við mínum bakgrunni. Ekkert nám hefði betur passað við mitt áhugasvið og er ég þakklátur starfsfólki deildarinnar fyrir þeirra góða starf. Sérstaklega vil ég koma á framfæri þakklæti til Kristins Péturs Magnússonar prófessors í Auðlindadeild fyrir leiðsögn í verkefninu, stuðning og hvatningu og fyrir að kveikja áhuga minn á sameindaerfðafræði fyrir lífstíð. Mary Mavrikidi fær þakkir fyrir þátt hennar í rannsóknarvinnunni, fagmannleg vinnubrögð og skemmtilegur félagsskapur voru ómetanleg í rannsóknarvinnunni. Eiginkona mín Auðbjörg Halla Jóhannsdóttir fær þakklæti fyrir mikinn stuðning, þolinmæði og yfirlestur í gegnum þrjú ár af námi með fullri vinnu. Dætur mínar þær Unnur Birna, Hrafnhildur og Anna Steinunn fá hrós fyrir mikla þolinmæði og stuðning og hlakka ég til að geta eitt meiri tíma með þeim þegar ég útskrifast. Þakklæti fá foreldrar mínir fyrir að gefast aldrei upp á að hvetja mig til að fara í háskóla og læra meira. Að lokum vil ég þakka samnemendum fyrir samveruna. Það myndaðist frábær stemmning í hópnum og margar góðar minningar. Vestmannaeyjum, 10. apríl 2017 Hallgrímur Steinsson iv Útdráttur Cathelicidin eru örverudrepandi peptíð í hryggdýrum sem eru hluti af meðfædda ónæmiskerfi hryggdýra. Markmið verkefnisins var að skilgreina cathelicidin genasvæðið í fjallrjúpu og að spá fyrir um aminosýruröð peptíðanna og tjáningu þeirra. Fjögur cathelicidin prótín eru tjáð í kjúkling (Gallus gallus) og voru þær raðir notaðar til að staðsetja genin í fjallrjúpu (Lagopus muta) með notkun nýlega samsetts erfðamengis. Erfðamengið var síðan notað til að hanna PCR primera til að geta raðgreint cathelicidin svæðið að fullu. Skilgreiningin á cathelicidin svæðinu leiddi í ljós að öll cathelicidin genin sem kjúklingar og kalkúnar (Meleagris gallopavo) hafa eru líka til staðar í fjallrjúpunni. Genin eru CATHL1, CATH2, CATH3 og CATHB1 en genin KLH18 og TBRG4 eru til hliðar við þau í sömu röð á litning 2. Genin raðast á 15 kb. svæði sem er af sömu stærð og í kjúkling. Gæði raðgreiningarinnar eru góð að frátöldum tveim ~100bp götum. Niðurstöðurnar innihéldu útraðirnar fyrir öll virku peptíðin á cathelicidin genunum. RT-qPCR leiddi í ljós að öll cathelicidin genin voru tjáð í átta vefjum sem voru rannsakaðir. Þýðing á lesrömmum genanna sýndi breytingar á öllum fjórum cathelicidin genunum miðað við kjúkling og kalkún. CATHL1, CATH2, CATH3 sýndu mesta samsvörun við kjúkling en CATHB1 við kalkún. Lykilorð: Örverudrepandi peptíð, erfðamengjafræði, RNA, PCR, RT-qPCR. v Contents 1 Introduction ............................................................................................................................ 1 2 Background ............................................................................................................................ 3 2.1 Antimicrobial peptides .................................................................................................... 3 2.2 Cathelicidins .................................................................................................................... 5 2.3 Expression and function of avian cathelicidins ............................................................... 7 2.4 Research methods and data analysis in molecular genetics ............................................ 7 2.4.1 PCR ........................................................................................................................... 8 2.4.2 Gel electrophoresis .................................................................................................... 9 2.4.3 Sequencing methods ............................................................................................... 10 2.4.4 Bioinformatics analysis of data ............................................................................... 12 3 Materials and methods ......................................................................................................... 14 4 Results .................................................................................................................................. 20 4.1 PCR results .................................................................................................................... 20 4.2 Sequencing results ......................................................................................................... 22 4.3 Sequence analysis .......................................................................................................... 23 5 Discussion ............................................................................................................................ 28 6 Conclusions .......................................................................................................................... 31 7 References ............................................................................................................................ 32 vi Index of figures and tables FIGURE 1 – A SCHEMATIC DIAGRAM OF AVIAN CATHELICIDIN GENES (CHENG ET AL., 2015). ARROWS INDICATE THE ORIENTATION OF THE GENES AND * POINT OUT PSEUDOGENES. 5 FIGURE 2 - A DNA ELECTROPHORESIS GEL WITH PCR RESULTS, LADDERS AND LOADED WITH SYBR SAFE. ............................................................................................................................................... 10 FIGURE 3 - GENOMIC REGION IN CHICKEN CONTAINING CATHELICIDIN GENES (YATES ET AL., 2015). ........................................................................................................................................................... 14 FIGURE 4 - A VISUALIZATION OF THE RESULTS FROM THE PRIMERDESIGN-M PRIMER SELECTION (HIV SEQUENCE DATABASE, 2017) ............................................................................... 18 FIGURE 5 - MIXED RESULTS FROM FIRST PCR RUN ................................................................................. 20 FIGURE 6 - BANDS COVERING CATH3-CATH2 REGION IN LAGOPUS MUTA IN TOP ROW LANES 17-19. ........................................................................................................................................................... 21 FIGURE 7 - PRIMERDESIGN-M DESIGNED PRIMERS USED FOR PCR GETTING GOOD QUALITY PRODUCTS FOR MOST OF THE CATH REGION RANGING FROM KHL18 TO TBRG4. ............... 22 FIGURE 8 – VISUALIZATION FROM CODEONCODE ALIGNER OF ALIGNMENT USING THE SANGER SEQUENCES FROM THE STUDY AGAINST THE DRAFT GENOME OF LAGOPUS MUTA. .......................................................................................................................................................