UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E PATOGÊNICOS Colletotrichum spp. ISOLADOS DE GUARANAZEIRO (Paullinia cupana H.B.K. var. sorbilis (Mart.) Ducke) PEDRO DE QUEIROZ COSTA NETO Manaus-AM Junho-2009 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E PATOGÊNICOS Colletotrichum spp. ISOLADOS DE GUARANAZEIRO (Paullinia cupana var. sorbilis H.B.K. (Mart.) Ducke) PEDRO DE QUEIROZ COSTA NETO ORIENTADOR: Prof. JOSÉ ODAIR PEREIRA, Dr. Tese apresentada ao Programa Multi- Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Federal do Amazonas, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia, Área de Concentração: Conservação e Uso de Recursos Genéticos Microbianos da Amazônia. Manaus-AM Junho-2009 Ficha Catalográfica 1. Jasmonatos 2. Região ITS 3. AFLP 4. Botryosphaeria rhodina Costa Neto, Pedro de Queiroz C837c Caracterização molecular de fungos endofíticos e patogênicos Colletotrichum spp. isolados de guaranazeiro (Paullin ia cupana H.B.K. var. sorbilis (Mart.) Ducke) / Pedro de Queiroz Costa Neto. 2009 100 f.: il. color; 31 cm . Orientador: José Odair Pereira Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Amazonas. 1. Antracnose. 2. Guaraná. 3. Variabilidade genética 4. Amazônia. I. Pereira, José Odair II. Universidade Federal do Amazonas III. Título UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PÓS- GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA TESE DE DOUTORADO TÍTULO: CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E PATOGÊNICOS Colletotrichum spp. ISOLADOS DE GUARANAZEIRO (Paullinia cupana var. sorbilis H.B.K. (Mart.) Ducke) ORIENTADO: PEDRO DE QUEIROZ COSTA NETO ORIENTADOR: Prof. JOSÉ ODAIR PEREIRA, Dr. Felipe Costa, Wellinson d’Ângelo Sobrinho e João Cleiboni Costa, nessa jornada além da relação pai e filho, somos amigos, a vocês: Dedico À todos aqueles que me possibilitaram a oportunidade de ampliar conhecimentos, quer seja na condição de aluno ou professor, a vocês: Ofereço AGRADECIMENTOS Àquele que sempre, em todos os momentos, nunca me desamparou, guia-me por veredas da justiça e da mansidão, nosso Deus. À Universidade Federal do Amazonas pela oportunidade da qualificação científica ofertada a todos os seus servidores. À Embrapa, pela coleta de material vegetal para isolamento de fungos. À Universidade de Ribeirão Preto/UNAERP, na pessoa da Profa. Dra. Suzelei, pela oportunidade de estágio no Laboratório de Biotecnologia, onde aprendi a técnica molecular AFLP. Aos professores do Departamento de Ciências Fundamentais e Desenvolvimento Agrícola da Faculdade de Ciências Agrárias da UFAM, pela liberação para realizar esse Curso. Aos professores do Colegiado do Curso de Ciências Agrárias e do Ambiente do Instituto Natureza e Cultura do Pólo Alto Solimões da UFAM, pela oportunidade de continuar e concluir esse Curso. Ao Prof. Dr. José Odair Pereira, pela orientação, estímulo, oportunidades e amizade. À Profa. Dra. Bianca Bertoni pela disponibilidade do seu tempo para orientação no aprendizado da técnica AFLP, pela amizade construída e incentivo contínuo. Ao corpo docente do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da UFAM, pela oportunidade de ampliar conhecimentos e amizades estabelecidas. Aos companheiros da jornada científica Profa. Dra. Rozana Medeiros-Galvão, Profa. Dra. Izeni Pires, Profa. Dra. Doriane Rodrigues, Profa. Dra. Maria das Neves, Profa. MSc. Aline Rondon, Profa. MSc. Ieda Batista, Profa. MSc. Luciana Barbosa, Profa. MSc. Luciana Souza, MSc. Helena Kazuko, MSc. Taciana Amorim, MSc. Wallace Batista, Chelzea Mara, Sâmara, Cláudia Guedelha, pela colaboração na realização desse trabalho e amizade fortalecida nas árduas diárias de laboratório e salas de aula. Aos companheiros do Laboratório de Princípios Bioativos de Origem Microbiana/LPBOM: Profa. Dra. Antonia Queiroz, Dra. Ágata, MSc. Gabriela, Socorro, Auricélia (Chaveirinho), Ismael e Alessandra, pela colaboração e amizade nas longas horas compartilhadas. Às Mestras Liene Rocha (morena) e Raquel (loira), meus braços direito e esquerdo no final da jornada, sou grato pela disponibilidade na colaboração e paciência, pela amizade construída e amor ao AFLP. A todos os companheiros que trabalham no Centro de Apoio Multi-disciplinar, em especial Prof. Dr. Spartaco Filho, Prof. Dr. Edimar, Elza Quadros, Enedina, Jhoson, Tiago, Diego, Rogério, Gabriela, Izabel Porto, Roberto, Josué e Patrícia, muito obrigado pela colaboração em discussões científicas, material de trabalho e amizade. A uma turma da ajuda da última hora: MSc. Rafaela Santos, MSc. Conceição Freitas, Edvaldo Pereira, Mário Nunes, Jaqueline Macêdo, Aldenice Melara, Rúbia, Celina Botelho, Gilsimar, José Nascimento, Jocélio, Rodrigo Reis, Benedito Maciel, Lunalva, Roberto Mafra, Cristian e Paulezina Viana, direta ou indiretamente vocês contribuíram para a realização desse trabalho, muito obrigado. Themis Silva, obrigado pela amizade, por lembrar-me que Deus se faz sempre presente em nós, pela colaboração nesse trabalho, mesmo distante você está presente! Aos amigos de Sena Madureira, pelo apoio e torcida na concretização desse sonho, que compartilho com cada um de vocês, em especial: Gercineide Fernandes, Antônia Queiroz, Januária Queiroz, Dandara Costa, Giseuda Monteiro, Sílvia Queiroz, Alodia Queiroz e Cleide Queiroz. Thaysa Nogueira, muito obrigado pela contribuição na elaboração final desse trabalho, paciência e incentivo. Ao meu irmão Carlos Alexandre e esposa, pelo apoio e compreensão quando necessitei para concretizar esse meu sonho. Muito obrigado! Meus filhos, Felipe, Wellinson d’Ângelo e João Cleiboni, muito obrigado pelo apoio, compreensão e colaboração na realização desse sonho compartilhado intensamente com cada um de vocês. Meus pais, Cleiboni e Hedy, minha avó Luiza, e minha tia Francisca, in memorian, por todos os momentos presentes, nas alegrias e nas tristezas, e pelo eterno amor. LISTA DE TABELAS Quantidade de isolados, hospedeiros, fragmento de isolamento, Tabela 1 patogenicidade e procedência de Colletotrichum spp. Analisados 28 ........ Tabela 2 Fungos endofíticos de guaranazeiro, do gênero Colletotrichum, demonstrando os isolados obtidos a partir de um único folíolo ............ 53 Tabela 3 Relação dos isolados de Colletotrichum, identificados em nível de espécie, por comparação de seqüências das regiões ITS1-ITS2 e subunidades 5,8S do gene rDNA com o banco de informações NCBI . 60 Tabela 4 Relação dos isolados correspondentes a cada um dos nove haplótipos com mais de um representante, encontrados em três subpopulações de Colletotrichum gloeosporioides/Glomerella cingulata isolados de guaranazeiro, açaizeiro e Rollinia sp. .................................................... 70 Tabela 5 Sítios polimórficos evidenciando a discriminação de 28 haplóticos entre os 68 indivíduos – dez Glomerella cingulata e 58 Colletotrichum gloeosporioides isolados de Paullinia cupana de Manaus e Maués, e de Euterpe oleraceae, Rollinia sp. e Strychnos sp. de Manaus. Foram observadas uma transversão (T → A), oito transições e 11 inserções/deleções em fragmento de 479 pares de bases. As regiões monomórficas são indicadas por ponto. N corresponde ao número de indivíduos observados dentro de cada haplótipo. P representa a proporção do haplótipo ................................. 72 Tabela 6 Distribuição dos 28 haplótipos de Colletotrichum gloeosporioides/Glomerella cingulata em função do hospedeiro e localidade .............................................................................................. 73 Tabela 7 Análise da variabilidade genética por meio de variância molecular (AMOVA) dentro e entre subpopulações e Índice de Fixação (FST) de Colletotrichum/Glomerella, isolados de Paullinia cupana var. sorbilis 80 Tabela 8 Combinação de pares de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos fragmentos gerados pelos cortes das enzimas de restrição ................................................................................................. 81 LISTA DE FIGURAS Grupo de genes do DNA ribossomal, compreendendo os três Figura 1 principais (18S, 5,8S e 28S), a região espaçadora intergênica (IGS), e as regiões espaçadoras internas (ITS). A região IGS compreende o gene 5S. As regiões ITS são mais variáveis enquanto as principais são conservadas. ITS1 e ITS4 localização de anelamento dos oligonucleotídeos para amplificação de parte do gene rDNA. (Adaptado de Mitchell e Zuccaro, 2006) .............................................. 22 Figura 2 Colônias de Colletotrichum armazenadas em dois métodos: Castellani e Óleo mineral 55 ....................................................................................... Figura 3 Fenótipos de colônias monospóricas de Colletotrichum spp., isoladas de folíolos de Paullinia cupana var. sorbilis. EGM e EGF são isolados endofíticos e PGM, patogênicos ............................................. 56 Figura 4 Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo e revelado sob luz ultravioleta. Revelação do DNA genômico extraído de Colletotrichum spp. M – Marcador de peso molecular Low DNA Mass Ladder; isolados EGM1, EGM4, EGM8, EGM21, EGM23, EGM25, EGM26, EGM27, EGM28 e EGM31 .................................... 58 Figura 5 Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo e revelado sob luz ultravioleta mostrando amplificação por PCR das regiões ITS1-ITS2 e 5,8S do gene rDNA de isolados de Colletotrichum obtidos em