Hydrolysoituvien tanniinien rakenteen vaikutus niiden makromolekyyliaffiniteettiin Joona Arvola Pro gradu -tutkielma Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä Kemian laitos Turun yliopisto Joulukuu 2019 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä. _________________________________________________________________________ TURUN YLIOPISTO Kemian laitos ARVOLA, JOONA: Hydrolysoituvien tanniinien rakenteen vaikutus niiden makromolekyyliaffiniteettiin Pro gradu -tutkielma, 80 s., liitteet 10 s. Kemia Joulukuu 2019 Hydrolysoituvat tanniinit ovat rakeenteiltaan hyvin monipuolinen joukko luonnonyhdisteitä, joilla on havaittu olevan kyky sitoutua makromolekyyleihin. Eniten on tutkittu niiden kykyä sitoutua proteiineihin, mutta myös mm. polysakkaridien kanssa on tehty tutkimuksia. Kun hydrolysoituvat tanniinit sitoutuvat makromolekyyleihin, muodostavat ne liukoisia ja liukenemattomia tanniini–makromolekyyli -komplekseja, joita voidaan tutkia monilla erilaisilla menetelmillä. Eniten on tutkittu tanniini–proteiini -komplekseja, jotka ovat muodostuneet heikkojen vuorovaikutusten johdosta. Heikkoja vuorovaikutuksia ovat hydrofobiset voimat ja vetysidokset, jotka muodostuvat hydrolysoituvien tanniinien fenolisten ryhmien ja proteiinien hydrofobisten ja hydrofiilisten kohtien välille. Hydrolysoituvien tanniinien proteiiniaffiniteettiin vaikuttavat eniten fenolisten ryhmien lukumäärä niiden rakenteessa, mutta erilaiset fenoliset ryhmät vaikuttavat kuitenkin eri tavoin yhdisteiden affiniteettiin. Yhdisteiden korkea molekyylipaino ja mahdollisimman joustava rakenne vaikuttavat niiden proteiiniaffiniteettiin kasvattavasti. Pienempiä eroja proteiiniaffiniteeteissa voidaan havaita esimerkiksi galloyyliryhmien sijoittumisella yhdisteen rakenteessa ja stereoisomerialla. Kun näiden eri tekijöiden vaikutusta yhdisteiden proteiiniaffiniteettiin arvioidaan, tehdään rakenne–aktiivisuus -tutkimusta. Tämän tutkielman kirjallisessa osassa käytiin läpi hydrolysoituvien tanniinien rakenteita ja tutkittiin, mitkä tekijät vaikuttivat tanniinien sitoutumiseen proteiineihin. Tässä osassa keskityttiin erityisesti löytämään ne rakenteelliset tekijät hydrolysoituvissa tanniineissa, jotka vaikuttivat niiden proteiiniaffiniteettiin kasvattavasti. Sen lisäksi havaittiin, että esimerkiksi yhdisteiden vesiliukoisuudella ja Sephadex LH-20 -geelikromatografialla voitiin ennustaa niiden proteiiniaffiniteettia. Lopuksi tarkasteltiin vielä erikseen tanniini– polysakkaridi -vuorovaikutuksia. Tutkielman kokeellisessa osassa mitattiin, kuinka 28 hydrolysoituvaa tanniinia muodostivat liukenemattomia tanniini– makromolekyyli -komplekseja naudan seerumin albumiinin ja polyetyleeniglykolin kanssa. Sen lisäksi yhdisteille määritettiin kolme kemiallista ominaisuutta: Sephadex LH- 20 -pidättyminen ja jakautumiskertoimet kahdella eri liuotinparilla. Lopputuloksissa saatuja bioaktiivisuustuloksia perusteltiin hydrolysoituvien tanniinien rakenteilla ja niille mitatuilla kemiallisilla ominaisuuksilla. _________________________________________________________________________ Asiasanat: hydrolysoituva tanniini, makromolekyyli, tanniini–makromolekyyli -kompleksi, proteiiniaffiniteetti, rakenne–aktiivisuus -tutkimus _________________________________________________________________________ Sisällys 1. Johdanto ........................................................................................................................ 1 KIRJALLINEN OSA 2. Hydrolysoituvat tanniinit ............................................................................................ 4 2.1. Yleistä tanniineista ...................................................................................................... 4 2.2. Galloyyliglukoosit ja gallotanniinit............................................................................. 4 2.3. Ellagitanniinit .............................................................................................................. 6 3. Makromolekyylit .......................................................................................................... 7 4. Hydrolysoituvien tanniinien ja proteiinien väliset vuorovaikutukset ......................... 9 4.1. Yleistä hydrolysoituvien tanniinien ja proteiinien välisistä vuorovaikutuksista......... 9 4.2. Hydrolysoituvien tanniinien rakenteen vaikutus proteiiniaffiniteettiin .................... 12 4.2.1. Galloyyliglukoosien rakenteen vaikutus proteiiniaffiniteettiin .......................... 12 4.2.2. Gallotanniinien rakenteen vaikutus proteiiniaffiniteettiin ................................. 16 4.2.3. Ellagitanniinien rakenteen vaikutus proteiiniaffiniteettiin ................................. 18 4.3. Hydrolysoituvien tanniinien vesiliukoisuuden vaikutus proteiiniaffiniteettiin ......... 26 4.4. Proteiinien rakenteen vaikutus affiniteettiin ............................................................. 28 5. Hydrolysoituvien tanniinien ja polysakkaridien välinen vuorovaikutus .................. 29 5.1. Yleistä hydrolysoituvien tanniinien ja polysakkaridien välisistä vuorovaikutuksista .......................................................................................................................................... 29 5.2. Hydrolysoituvien tanniinien rakenteen vaikutus Sephadex-kromatografiaan .......... 30 5.3. Hydrolysoituvien tanniinien rakenteen vaikutus vuorovaikutukseen selluloosan kanssa ............................................................................................................................... 32 KOKEELLINEN OSA 6. Materiaalit ja menetelmät ............................................................................................. 36 6.1. Reagenssit ................................................................................................................. 36 _________________________________________________________________________ 6.2. Puhdasaineet...............................................................................................................36 6.3. Nestekromatografia ja massaspektrometria ...............................................................40 6.4. Sephadex LH-20 -kromatografia ...............................................................................40 6.5. Neste-nesteuutot .........................................................................................................42 6.6. Hydrolysoituvien tanniinien ja naudan seerumin albumiinin väliset liukenemattomat kompleksit .........................................................................................................................44 6.7. Hydrolysoituvien tanniinien ja polyetyleeniglykolin väliset liukenemattomat kompleksit .........................................................................................................................46 7. Tulokset ja niiden tarkastelu .........................................................................................48 7.1. Sephadex LH-20 -kromatografia ...............................................................................48 7.2. Neste-nesteuutot .........................................................................................................50 7.3. Hydrolysoituvien tanniinien ja naudan seerumin albumiinin väliset liukenemattomat kompleksit .........................................................................................................................53 7.4. Hydrolysoituvien tanniinien ja polyetyleeniglykolin väliset liukenemattomat kompleksit .........................................................................................................................62 7.5. Hydrolysoituvien tannniinien bioaktiivisuuksien ja kemiallisten ominaisuuksien vertailu ..............................................................................................................................68 8. Johtopäätökset .................................................................................................................73 Viitteet ...................................................................................................................................76 Liite 1. ...................................................................................................................................81 Liite 2. ...................................................................................................................................82 Liite 3. ...................................................................................................................................83 Liite 4. ...................................................................................................................................84 Liite 5. ...................................................................................................................................85 Liite 6. ...................................................................................................................................86 Liite 7. ...................................................................................................................................87 _________________________________________________________________________ Liite 8. .................................................................................................................................. 88 Liite 9. .................................................................................................................................. 89 Liite 10. ...............................................................................................................................