“I could be bounded in a nutshell and count myself the king of infinite space were it not that I have bad dreams…” William Shakespeare,1609. Hamlet . Acto II. Escena IV. “…the characters which naturalists consider as showing true affinity between any two or more species, are those which have been inherited from a common parent, all true classification being genealogical;—that community of descent is the hidden bond which naturalists have been unconsciously seeking, and not some unknown plan of creation, or the enunciation of general propositions, and the mere putting together and separating objects more or less alike.” Charles Robert Darwin, 1859. The origin of Species. “Nothing in biology makes sense except in the light of evolution.“ Theodosius Dobzhansky, 1973. The American Biology Teacher. 1 AISLAMIENTO DE CANDIDATOS A GENES DE RESISTENCIA CONTRA LA MANCHA ANGULAR DE LA HOJA EN EL FRIJOL COMUN Fausto Rodríguez Zapata. Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de biólogo. Director: Joe Tohmé, Genetista, Ph.D. Primer Codirector: Catalina Romero, Bióloga. Segundo Codirector: Alfredo Badillo, Biólogo, Ph.D. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES Facultad de Ciencias Departamento de Ciencias Biológicas Bogotá D. C. 2 AISLAMIENTO DE CANDIDATOS A GENES DE RESISTENCIA CONTRA LA........................2 1. OBJETIVOS.......................................................................................................................8 1.1. OBJETIVO GENERAL..........................................................................................................8 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................................................8 2. MARCO TEORICO........................................................................................................... 10 2.1. FRÍJOL......................................................................................................................... 10 2.1.1. Caracteres vegetativos............................................................................................. 10 2.1.2. Caracteres reproductivos. ........................................................................................ 11 2.1.3. El fríjol como producto alimenticio y de importancia económica...................................... 12 2.1.4. Diversidad............................................................................................................. 14 2.1.4.1. Contexto filogenético de Phaseolus vugalris..................................................................................................14 2.1.4.2. Acervos genéticos del fríjol común y diversidad intraespecífica ................................................................17 2.2. PLANTAS DE FRÍJOL UTILIZADAS EN EL AISLAMIENTO DE HOMÓLOGOS DE GENES DE RESISTENCIA DEL LOCUS RGC7...................................................................................................................... 26 2.2.1. G19833................................................................................................................. 27 2.2.2. DOR364................................................................................................................ 28 2.2.3. ‘Sprite’.................................................................................................................28 2.3. MANCHA ANGULAR DE LA HOJA....................................................................................... 31 2.3.1. Distribución........................................................................................................... 32 2.3.2. Importancia económica............................................................................................ 32 2.3.3. Taxonomía y afinidades evolutivas de P. griseola.......................................................... 34 2.3.4. Espectro de hospederos............................................................................................ 36 2.3.5. Síntomas............................................................................................................... 36 2.3.6. Proceso de infección................................................................................................ 37 2.3.7. Diversidad............................................................................................................. 41 2.3.8. Herencia y fuentes de resistencia contra la mancha angular en el fríjol común................... 44 2.4. RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN PLANTAS....................................................................... 47 2.4.1. Sistema inmune innato............................................................................................. 48 2.4.2. Hipótesis del “gen por gen”...................................................................................... 51 2.4.3. Genes de resistencia como receptores del sistema inmune innato: las proteínas de resistencia poseen una arquitectura modular....................................................................................... 52 2.4.3.1. Dominio TIR (Toll-Interleukin 1 receptor- Resistance)...............................................................................54 2.4.3.2. Dominio de unión a nucleótido NBS (Nucleotide Binding Site)................................................................55 2.4.3.3. Dominio de repeticiones ricas en leucina LRR (Leucine Rich repeats).....................................................56 2.4.3.4. Dominio de bucles superenrollados CC (Coiled Coil)..................................................................................59 2.4.3.5. Dominio de kinasa serina/treonina STK (Serine/Threonin Kinase)............................................................59 2.4.3.6. Interacciones intramoleculares...........................................................................................................................61 2.4.3.7. Hipótesis del gen guardián..................................................................................................................................64 2.4.4. Estructura y evolución de clústers de genes de resistencia. ............................................ 67 2.4.4.1. Estructura y función.............................................................................................................................................67 2.4.4.2. Evolución de los clústers de genes R..............................................................................................................70 2.5. MAPEO DE QT L S Y AISLAMIENTO (CLONACIÓN) DE GENES DE RESISTENCIA................................ 74 3. MATERIALES Y METODOS............................................................................................. 76 3.1. MATERIAL VEGETAL....................................................................................................... 76 3.2. MAPEO DE MICROSATÉLITES Y ANÁLISIS DE QTL.................................................................. 76 3.3. AISLAMIENTO DE CANDIDATOS DE GENES DE RESISTENCIA HOMÓLOGOS A RGC7 EN EL GENOTIPO RESISTENTE G19833............................................................................................................. 79 3.4. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS............................................................................................ 84 3.4.1. Ensamblaje de contigs............................................................................................. 84 3.4.2. Anotación de secuencias de ADN: determinación de exones e intrones.............................. 88 3.4.3. Anotación de las proteínas predichas: Determinación de dominios y motivos proteicos conservados. .................................................................................................................. 92 4 3.4.4. Método iterativo de anotación basado en la construcción de un alineamiento múltiple anotado. .................................................................................................................................... 93 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................................... 96 4.1. MAPEO DE MICROSATÉLITES Y ANÁLISISIS DE QTL...............................................................96 CORRELACIÓN CON LA RESISTENCIA.............................................................................102 MARCADOR.......................................................................................................................102 4.2. AISLAMIENTO DE HOMÓLOGOS A GENES DE RESISTENCIA DEL LOCUS RGC7..............................107 4.3. ANOTACIÓN DE LAS SECUENCIAS ENCONTRADAS.................................................................110 4.3.1. Anotación de secuencias de ADN: determinación de exones e intrones.............................114 4.3.2. Anotación de las proteínas predichas: Determinación de dominios y motivos proteicos conservados. .................................................................................................................119 4.3.2.1. Dominio TIR de la familia RGC7..................................................................................................................123 4.3.2.2. Fragmentos NBS................................................................................................................................................130 4.3.2.3. Repeticiones Ricas en Leucina........................................................................................................................131 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS...............................................................................133