Phylogenie und Phylogeographie eurasischer Viperinae unter besonderer Berücksichtigung der orientalischen Vipern der Gattungen Montivipera und Macrovipera Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte D i s s e r t a t i o n von Nikolaus Stümpel aus Braunschweig 1. Referent: apl. Professor Dr. Ulrich Joger 2. Referent: Professor Dr. Miguel Vences eingereicht am: 19.09.2011 mündliche Prüfung (Disputation) am: 19.01.2012 Druckjahr 2012 Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissenschaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Publikationen Stümpel, N. & U. Joger (2009): Recent advances in phylogeny and taxonomy of Near and Middle Eastern Vipers – an update. – Zookeys 31: 179-191. Tagungsbeiträge Stümpel, N. & U. Joger: “First steps towards a molecular phylogeny of Near- and Middle East Mountain and Blunt-nosed vipers of the genera Montivipera and Macrovipera ” – 2nd Biology of the Vipers conference, 24-27 September 2007, Porto, Portugal Stümpel, N. & U. Joger: “Phylogeny of Near and Middle East Mountain and Blunt-nosed Vipers of the genera Montivipera and Macrovipera inferred by three mitochondrial markers” – 6th World Congress of Herpetology, 17-22 August 2008, Manaus, Brasil Stümpel, N. & U. Joger: “Phylogeny of Near and Middle East Mountain and Blunt-nosed Vipers of the genera Montivipera and Macrovipera inferred by mitochondrial and nuclear markers” – 15th European Congress of Herpetology, 28th September to 2nd October 2009, Kuşadası, Turkey Stümpel, N. & U. Joger: “Phylogeny and molecular clock analyses of west Palearctic Vipers based on complete mitochondrial genomes” – 3rd Biology of the Vipers conference, 31st March-2nd April 2010, Pisa, Italy Für meine lieben Eltern Klaus und Dorothee Stümpel, die mein exotisches Interesse toleriert haben und mich nach Kräften unterstützt haben. Inhalt 1 Vorwort ................................................................................................................................................ 1 2 Material und Methoden ....................................................................................................................... 5 2.1 Probenmaterial .............................................................................................................................. 5 2.1.1 Einleitung ................................................................................................................................ 5 2.1.2 Herkunft des verwendeten Probenmaterials ......................................................................... 6 2.2 Chemikalien, Reagenzien, Kits, Verbrauchsmaterialien und Hilfsmittel ....................................... 7 2.3 Laborgeräte ................................................................................................................................... 8 2.4 Labormethodik .............................................................................................................................. 8 2.4.1 DNA-Isolierung ....................................................................................................................... 8 2.4.2 PCR Methoden........................................................................................................................ 9 2.4.2.1. Auswahl der Markergene ............................................................................................... 9 2.4.2.2 Primerdesign ................................................................................................................. 13 2.4.2.3 Amplifizierung proteincodierender mt-Gene ................................................................ 15 2.4.2.4 Amplifizierung vollständiger mt-Genome mit Hilfe der long and accurate PCR ........... 16 2.4.2.5 Amplifizierung von Kerngenen ...................................................................................... 21 2.4.2.6 Aufreinigung der PCR-Produkte .................................................................................... 24 2.4.3 DNA-Sequenzierung ............................................................................................................. 24 2.4.3.1 Cycle-Sequencing (Sanger Reaktion) ............................................................................. 25 2.4.3.2 Aufreinigung der Cycle-Sequencing-Produkte .............................................................. 25 2.4.3.3 Sequenzierung und Assembling .................................................................................... 26 2.5 Analytische Methoden ................................................................................................................ 26 2.5.1 Alignments ............................................................................................................................ 26 2.5.2 Annotation der Mitogenome ............................................................................................... 28 2.5.3 Stammbaumrekonstruktion und -validierung ...................................................................... 29 2.5.3.1 Sättigungsanalysen ........................................................................................................ 29 2.5.3.2 Berechnung des Evolutionsmodells .............................................................................. 31 2.5.3.3 Wahl der Außengruppen ............................................................................................... 32 2.5.3.4 Evaluation von Stammbäumen („Branch-support“) ..................................................... 32 2.5.3.5 Rekombinationsanalyse ................................................................................................ 33 2.5.3.6 Kongruenz-Test verschiedener Topologien ................................................................... 34 2.5.3.7 Maximum Parsimonie (MP) ........................................................................................... 34 2.5.3.8 Maximum Likelihood (ML) ............................................................................................. 35 2.5.3.9 Bayesianische Inferenz (BI) ............................................................................................ 36 2.5.4 Phylogeographie ................................................................................................................... 37 2.5.5 Kalibrierung einer molekularen Uhr ..................................................................................... 38 2.5.6 Dispersal-Vicariance-Analyse ............................................................................................... 44 2.5.7. Historische Populationsdemographie ................................................................................. 44 3 Phylogenie der Viperinae auf Basis vollständiger mt-Genome .......................................................... 46 3.1 Einleitung ..................................................................................................................................... 46 3.2 Ergebnisse ................................................................................................................................... 49 3.2.1 Sequenz- und Sättigungsanalyse .......................................................................................... 49 3.2.2 Bayesianische Phylogenie ..................................................................................................... 51 3.2.3 mt-Genomorganistation der Viperinae ................................................................................ 54 3.3 Diskussion .................................................................................................................................... 57 4 Divergenzzeiten der Viperinae auf der Basis vollständiger mt-Genome ........................................... 64 4.1 Einleitung ..................................................................................................................................... 64 4.2 Ergebnisse ................................................................................................................................... 67 4.2.1 Auswirkung verschiedener „Relaxed-clock-models“ und „Tree-priors“ auf die Knotendivergenzzeiten .................................................................................................................. 67 4.2.2 Divergenzzeiten der Amnioten ............................................................................................. 70 4.3 Diskussion .................................................................................................................................... 73 5 Phylogenie eurasischer Viperinae ...................................................................................................... 81 5.1 Einleitung ..................................................................................................................................... 81 5.2 Ergebnisse ................................................................................................................................... 84 5.2.1 Sequenz- und Sättigungsanalyse .......................................................................................... 84 5.2.2 Phylogenie auf Basis konkatenierter Mitochondrien- und Kerngene .................................. 86 5.2.3 Phylogenie auf Basis von Kerngenen...................................................................................