UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID Departamento de Biología Molecular Bases genéticas de la respuesta radioadaptativa en timocitos de ratón Manuel Malavé Galiana Manuel Malavé Galiana Madrid, 2014 Departamento de Biología Molecular Facultad de Ciencias UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID Bases genéticas de la respuesta radioadaptativa en timocitos de ratón Manuel Malavé Galiana, Biotecnología Javier Santos Hernández, Pablo Fernández-Navarro, José Fernández-Piqueras Centro de Biología Molecular 1 Manuel Malavé Galiana D. José Fernández-Piqueras, Catedrático de Genética del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa/Universidad Autónoma de Madrid D. Javier Santos Hernández, Profesor Titular de Genética de la Universidad Autónoma de Madrid D. Pablo Fernández Navarro, Investigador Post-doc del Área de Epidemiología Ambiental y Cáncer del Centro Nacional de Epidemiología CERTIFICAN: Que Don Manuel Malavé Galiana ha realizado el trabajo de tesis doctoral que lleva por título “Bases Genéticas de la respuesta radioadaptativa en timocitos de ratón” bajo nuestra dirección y supervisión. Que, una vez revisado el trabajo, consideramos que éste tiene la debida calidad para su presentación y defensa. Y para que así conste a los efectos oportunos firmamos la presente en Madrid a 13 de noviembre de 2014. José Fernández-Piqueras Javier Santos Hernández Catedrático de Genética Profesor titular de Genética Dpto.Biología, UAM Dpto. Biología, UAM Centro de Biología Molecular Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, UAM-CSIC Severo Ochoa, UAM-CSIC Pablo Fernández Navarro Investigador Pos-Doc Miguel Servet Área de Epidemiología Ambiental y Cáncer, Centro Nacional de Epidemiología Instituto de Salud Carlos III, Madrid 2 Manuel Malavé Galiana INDICE I. AGRADECIMIENTOS. …..………………………………………………………… 6 II. RESUMEN. ………………………………………………………………………… 8 III. SUMMARY. ……………………………………………………………………….. 9 IV. ABREVIATURAS. ………………………………………………………………… 10 V. INTRODUCCIÓN. ………………………………………………………………... 13 1. Los genes de respuesta a la radiación ionizante: un regalo evolutivo……………. 13 2. Bajas dosis de radiación Ionizante y sus efectos biológicos…………………………… 14 3. La respuesta radioadaptativa………………………………………………………………………… 16 4. Mecanismos moleculares de la respuesta radioadaptativa……………………………. 17 5. El papel del gen Trp53 en el establecimiento de la respuesta radioadaptativa ……………………………………………………………………………………………………………………… 18 6. La ruta de señalización mediada por el gen Trp53 y la respuesta a la radiación ionizante……………………………………………………………………………………………………….. 20 7. El gen Trp53 participa en la apoptosis de timocitos inducida por la radiación ionizante……………………………………………………………………………………………………….. 21 8. La expresión génica como biomarcador de los efectos biológicos de la exposición a bajas dosis de radiación ionizante…………………………………………… 22 VI. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS.………………………………………………………… 23 VII. MATERIALES Y METÓDOS. …………………………………………………….. 24 1. Ratones y protocolos de irradiación……………………………………………………………… 24 2. Extracción del timo y aislamiento timocitos………………………………………………….. 25 3. Análisis de proteínas por “Western blotting” ……………………………………………….. 25 4. Estudio de los niveles de apoptosis……………………………………………………………….. 26 5. Análisis estadístico………………………………………………………………………………………… 26 3 Manuel Malavé Galiana 6. Análisis de micromatrices de ADNc……………………………………………………………….. 27 7. Análisis de expresión génica mediante Micromatriz de ADNc de dos colores………………………………………………………………………………………………………….. 27 8. Análisis estadístico………………………………………………………………………………………… 29 VIII. RESULTADOS. …………………………………………………………………... 33 A. Papel del gen Trp53 en la respuesta radioadaptativa de los timocitos de ratón………………………………………………………………………………………………………………………… 33 A.1. Los niveles de apoptosis inducidos por una dosis sub-letal de 1,75 Gy de rayos fluctúan a lo largo del tiempo en timocitos de ratones C57BL/6………………………. 33 A.2. Respuesta adaptativa de los timocitos frente a la apoptosis inducida por una dosis de 0.075 Gy de rayos X en ratones C57BL/6……………………………………………….. 35 A.3. La dosis condicionante de irradiación X reduce la formación de roturas de doble cadena en el ADN en los timocitos de ratones C57BL/6…………………………….. 36 A.4. La exposición a una dosis sub-letal de 1,75 Gy de rayos provoca una rápida fosforilación de Trp53 en la serina 18…………………………………………………………………. 38 A.5. La fosforilación de Trp53 en la serina 389 protege de la apoptosis y de la inducción de roturas de doble cadena en el ADN en timocitos de ratones expuestos al régimen adaptativo de radiación…………………………………………………………………….. 40 A.6. El aumento de fosfoserina-389-Trp53 en los timocitos radioadaptados va acompañado de una reducción simultánea en los niveles de fosforilación de la proteína Mdm2 en la serina 166…………………………………………………………………………. 42 A.7. Niveles máximos de expresión para la forma fosforilada de p38Mapk y de fosfoserina-389-Trp53 in timocitos radioadaptados……………………………………………. 43 A.8. La transcripción de los genes diana de Trp53 no juega un papel esencial en la respuesta radioadaptativa de los timocitos de ratones C57BL/6…………………………. 44 4 Manuel Malavé Galiana B. Análisis global de expresión transcripcional en timocitos de ratones C57BL/6 expuestos al régimen adaptativo de radiación…………………………………………………………. 50 B.1. Genes relacionados con las funciones biológicas del Trp53…….…………………… 50 B.1.1. Genes de reparación del ADN……………………………………………………………... 50 B.1.2. Genes de apoptosis……………………………………………………………………………… 51 B.1.3. Genes implicados en el control del ciclo celular…………………………………… 51 B.2. ARNs no codificantes intergénicos de tamaño largo…………………………………….. 52 B.3. Genes no relacionados con las funciones biológicas del Trp53…………………..… 56 IX. DISCUSIÓN. ……………………………………………………………..………. 58 X. CONCLUSIONES. ……………………………………………………….……….. 69 XI. BIBLIOGRAFÍA. ………………………………………………………………….. 70 XII. PUBLICACIÓN. …………………………………………………………………… 80 5 Manuel Malavé Galiana AGRADECIMIENTOS Llegados a este momento en que se acaba un trabajo que ha conllevado tanto tiempo y esfuerzos, personales y ajenos, no puedo evitar echar la vista atrás y recordar los pilares en los que me he ido apoyando para llegar a este momento que se parece bastante a una meta. Echar una mirada hacia esos sustentos personales que han hecho posible que el camino, duro y agradecido a un tiempo, llevara a algún lugar del que poder sentirse orgulloso como yo lo estoy ahora. En ese repaso, mi primer agradecimiento tiene que ir, sin duda, hacia mi Director de Tesis, el Dr. Javier Santos Hernández por darme la oportunidad de realizar este trabajo y por todo el conocimiento aportado. A mi co-director de tesis el Dr. Pablo Fernández Navarro, que con su entrega y dedicación ha conseguido que saque adelante el presente trabajo. A mi co-director el Dr. José Fernández Piqueras, por haberme empujado a la realización de este trabajo; su apoyo, entrega y dedicación ilimitada en la tarea asistencial e investigadora son un referente a seguir. Sin su ilusión, muchas cosas serían imposibles; de verdad gracias. A mi compañera la Dra. Laura González, porque todo lo pudiera decir no sería suficiente. Gracias por su ejemplo, su dedicación, su profesionalidad, por compartir el trabajo diario, por contagiarme su motivación y sobre todo porque ha sido la maestra que me ha enseñado a andar en el camino de la ciencia. A mi compañera la Dra. Pilar López, por todo lo que he podido aprender a su lado y por su gran ayuda que sin ella no lo habría conseguido. A todos mis compañeros/as del laboratorio 327, con quienes he compartido el espacio-tiempo durante todos estos años: Chini por todo lo que he podido aprender su lado, a Anamery por los buenos momentos vividos con las series, Maria de Arriba por cuidar tanto del laboratorio y mi persona, Maria Villa por su sabiduría y profesionalidad, José Luis por su consejos e Irene por su chispa y cariño. 6 Manuel Malavé Galiana No podía pasar por alto a los/as compis restantes que se fueron, Helena por ser la alegría de la huerta, Inma por ser mi primera maestra, Lury por los buenos momentos pasados en la cafe, Jacobo, Álvaro y Andrés por sus consejos, Beatriz por su simpatía y amabilidad, Celia y Bárbara porque me han demostrado ser grandes personas y sobre todo grandes amigas, con las que sé que podré contar siempre. Gracias a todos/as en definitiva por vuestro apoyo, comprensión y por llenarme el día a día de ilusión. Al grupo de Voley-Playa (de Madrid si...): Fernando, Helena, Stefano, Diana, Isa, Fulvio, Dani, Liam, Iñigo, Jesús (y todos los que no he puesto porque la lista se hace muy grande y ellos saben muy bien quienes son), gracias a todos/as por los grandes momentos que hemos compartido Me habéis demostrado que aparte de ser unos grandes jugadores, sois de las mejores personas que uno puede conocer en esta vida. Si en el mundo hubiera más gente como vosotros creo que todos seríamos más felices. Tampoco podía olvidarme de mis compis de la 4ª planta: Angie, Pilar, Heni, Eugenia, MLuisa, Sandra y Elena. Gracias por los buenos momentos que hemos compartido, sois geniales desde la primera hasta la última, da gusto conocer gente como vosotras con vuestra alegría y cariño. A Gema, gracias por tu infinita paciencia e incondicional apoyo en este tramo final de la tesis, ha sido tu constante motivación la que me ha permitido luchar día a día para alcanzar este objetivo. Y finalmente, y por supuesto no el menos importante, el agradecimiento más profundo y sentido va para mi familia. Sin su apoyo, colaboración e inspiración habría sido imposible llevar a cabo esta dura empresa. Con todo mi cariño y amor para mis padres, Manuel y