Analyse biologisch aktiver, oxidierter Lipide in Pflanzen und Menschen Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Kathrin Karg aus Nürnberg ______________ Würzburg, 2006 Dissertation eingereicht am: 08.08.2006 Mitglieder der Promotionskomission: Vorsitzender: Prof. Dr. Georg Nagel 1. Gutachter: Prof. Dr. Martin J. Müller 2. Gutachter: Prof. Dr. Petra Högger Tag des Promotionskolloquiums: 17.11.2006 Promotionsurkunde ausgehändigt am: 1 Abkürzungsverzeichnis AA Aminosäure (engl.: amino acid) ABA Abscisinsäure ACC 1-Aminocyclopropancarbonsäure avr avirulent BHT tert-Butylhydroxytoluol BSTFA N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid C18 ec octadecyl end capped CI positive chemische Ionisation (engl.: chemical ionization) COX Cyclooxygenase DIEPA N,N-Diisopropylethylamin EI Elektronenstoßionisation (engl.: electron impact) FG Frischgewicht GSH Glutathion GST Glutathion-S-Transferase IAA Indolessigsäure IPA Indolpropionsäure iP Isoprostane JA Jasmonsäure LnA Linolensäure (engl.: linolenic acid) LOX Lipoxygenase MS Massenspektrometrie NCI negative chemische Ionisation NH 2 Aminopropyl norVal Norvalin oANI ortho-Anisinsäure OPDA 12-Oxo-Phytodiensäure PFB Pentafluorbenzyl-Gruppe PG Prostaglandin PP Phytoprostan PPAR Peroxisomen-Proliferator aktivierte Rezeptoren Pst Pseudomonas syringae path. tomato (biotrophes Bakterium) Pst avr auf Arabidopsis thaliana avirulenter Pst-Stamm Pst vir auf Arabidopsis thaliana virulenter Pst-Stamm ROS reaktive Sauerstoffspezies (engl.: reactive oxygen species) RT Raumtemperatur rpm Umdrehungen pro Minute SA Salicylsäure SiOH Silica SOD Superoxid-Dismutase SPE Festphasenextraktion (engl.: solid phase extraction) TG Trockengewicht TMS Trimethylsilyl-Gruppe TPP Triphenylphosphin VPE Gasphasenextraktion (engl.: vapor phase extraction) 2 Inhaltsverzeichnis I Einleitung ........................................................................................5 I.1 Reaktive Sauerstoffspezies und Lipidperoxidation.................................................... 6 I.1.1 Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ......................................................................... 6 I.1.2 Oxidativer Stress .................................................................................................... 8 I.1.3 Mechanismus der Lipidperoxidation...................................................................... 8 I.2 Oxylipine im Tier..................................................................................................... 10 I.2.1 Bildung von Eikosanoiden ................................................................................... 10 I.2.2 Struktur und Nomenklatur der Prostaglandine und Isoprostane .......................... 15 I.2.3 Diffusion und Transport von Prostanoiden .......................................................... 17 I.2.4 Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR).................................... 24 I.2.5 Metabolismus von Prostaglandinen und Isoprostanen......................................... 27 I.3 Oxylipine in Pflanzen............................................................................................... 29 I.3.1 Enzymatisch gebildete Oxylipine: Jasmonate...................................................... 29 I.3.2 Autoxidativ gebildete Oxylipine: Phytoprostane ................................................. 32 I.4 Profil von Phytohormonen und anderen Metaboliten .............................................. 38 I.5 Ziele der vorliegenden Arbeit................................................................................... 39 II Material ..........................................................................................40 II.1 Untersuchungsmaterial............................................................................................. 40 II.1.1 Blütenpollen ..................................................................................................... 40 II.1.2 Speiseöle........................................................................................................... 40 II.1.3 Blut- und Urinproben ....................................................................................... 41 II.1.4 Pflanzenmaterial............................................................................................... 41 II.2 Chemikalien ............................................................................................................. 42 II.2.1 Standards.......................................................................................................... 42 II.2.2 Reagenzien ....................................................................................................... 42 II.2.3 Enzyme............................................................................................................. 43 II.3 Verbrauchsmaterial .................................................................................................. 43 II.4 Geräte ....................................................................................................................... 43 II.4.1 Arbeitsgeräte .................................................................................................... 43 II.4.2 Instrumentelle Analytik.................................................................................... 45 III Methoden.......................................................................................46 III.1 Behandlung der Pflanzen ......................................................................................... 46 III.1.1 Infektion mit Pseudomonaden.......................................................................... 46 III.1.2 Verwundung..................................................................................................... 46 III.2 Hydrolyse der Triacylglyceride in den Speiseölen .................................................. 47 III.2.1 Enzymatische Hydrolyse mit Pankreas-Lipase ................................................ 47 III.2.2 Alkalische Hydrolyse ....................................................................................... 47 III.3 Derivatisierungsmethoden........................................................................................ 48 III.3.1 Methylierung von Carbonsäuren...................................................................... 48 III.3.2 Herstellung von Pentafluorbenzylestern .......................................................... 48 III.3.3 Herstellung von Trimethylsilylethern .............................................................. 48 III.3.4 Methoximierung von Ketogruppen.................................................................. 49 III.3.5 Hydrierung von Doppelbindungen................................................................... 49 III.4 Bestimmung von Kreatinin ...................................................................................... 49 III.5 Chromatographische Methoden ............................................................................... 50 3 III.5.1 Festphasenextraktion........................................................................................ 50 III.5.2 Analytische HPLC............................................................................................ 50 III.5.3 Präparative HPLC ............................................................................................ 52 III.5.4 GC/MS ............................................................................................................. 52 IV Ergebnisse ....................................................................................55 IV.1 Bestimmung von Phytoprostanen............................................................................. 55 IV.1.1 Extraktion von Phytoprostanen........................................................................ 55 IV.1.2 Festphasenextraktion an Aminopropyl- und Silika-Material ........................... 55 IV.1.3 Bestimmung der einzelnen Phytoprostanklassen ............................................. 56 IV.1.4 Bestimmung von Phytoprostanen in Blütenpollen........................................... 61 IV.1.5 Bestimmung von Phytoprostanen in Speiseölen.............................................. 63 IV.1.6 Phytoprostan-Gehalt von autoxidierten Speiseölen ......................................... 79 IV.1.7 Dehydratisierung von PPD 1 und PPE 1 in künstlichem Magensaft................... 83 IV.1.8 Resorption und Exkretion von Phytoprostanen................................................ 85 IV.2 Herstellung [ 18 O]-markierter Standards ................................................................... 91 IV.2.1 Enzymkatalysierter Austausch ......................................................................... 92 IV.2.2 Säurekatalysierter Austausch ........................................................................... 95 IV.2.3 Rücktausch der Ketogruppe ............................................................................. 99 IV.2.4 Stabilität der markierten Carboxylgruppe........................................................ 99 18 IV.2.5 Einsatz [ O] 2-markierter Standards zur Analytik.......................................... 100 IV.3 Bestimmung von Phytohormonen und anderen Metaboliten in Pflanzen.............. 102 IV.3.1 Konventionelle Methoden.............................................................................. 102 IV.3.2 Modifizierte Methode nach Schmelz et al...................................................... 107 IV.3.3 Bestimmung