1 2 3 4 AGRADECIMENTOS Agradeço à Luciana Benjamin Benatti, Beatriz Benatti da Rocha e Silva e ao nenê que está chegando pelo amor, motivação e por estarem sempre ao meu lado me apoiando e incentivando; Aos meus pais, pela vida, incentivo, suporte e orientação; Às minhas irmãs, pela consagração do trio que formamos, e pela presença em todas as horas, mesmo estando longe; A todos os meus familiares, por participarem da minha vida e por me aceitarem como sou; Ao Professor Stephen, pela pequena parte de seu enorme conhecimento que foi possível ser transmitida e pela convivência, paciência e lições de profissionalismo; Aos Professores Maria Alice da Cruz Höfling, Carla Beatriz Collares Buzatto, Edson Antunes e Léa Rodrigues Simioni, por abrirem seus laboratórios e pela ajuda sempre atenciosa; Aos meus colegas de UNICAMP, pelo companheirismo de todas as horas; Aos Centros de Controle de Zoonoses, em especial os de Itú e Campinas pela parceria, sem a qual este trabalho não seria possível; Ao Dr. Alexandre E. Nowill e Gilberto C. Franchi Jr. do CIPOI, pela parceria e oportunidade; Ao Professor Hernandes Faustino de Carvalho, pela parceria e ajuda em momentos difíceis; Aos técnicos José Ilton, Toninho, Miguel, Marcos e o Biólogo Gildo pela ajuda e orientação e pelos bons momentos durante o trabalho; À Fapesp, pelo apoio financeiro, e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural pela formação. Agradeço também a todos os professores de minha vida até então, desde a Tia Cláudia, em 1981, até o Professor Igor A. Degterev, orientador de mestrado, por terem construído este aluno; A todos os meus amigos que, felizmente, são muito numerosos, espalhados pelo mundo, por uma das melhores coisas da vida: amizade; Aos amigos da espeleologia, por me mostrar e conduzir em lugares que realmente acalmam a alma. Agradeço a toda energia do universo, por permitir a criação deste planeta, dos seres vivos, dos humanos, do pensamento e desta tese de doutorado; Aos meus anjos da guarda, que tralham muito e estão sempre alegres, pela orientação e proteção em todos os momentos. 5 SUMÁRIO ABREVIATURAS ................................................................................................................................... 7 LISTA DE FIGURAS............................................................................................................................... 8 LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. 10 RESUMO ............................................................................................................................................ 11 ABSTRACT ......................................................................................................................................... 13 INTRODUÇÃO................................................................................................................................... 15 A FAMÍLIA THERAPHOSIDAE .....................................................................................................................15 ESTRUTURA DO APARATO VENENÍFERO ......................................................................................................18 EXTRAÇÃO DE PEÇONHAS .......................................................................................................................19 COMPOSIÇÃO DAS PEÇONHAS ...............................................................................................................20 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DAS PEÇONHAS .................................................................................................22 VARIAÇÃO NA COMPOSIÇÃO E AÇÃO DAS PEÇONHAS............................................................................30 NEUTRALIZAÇÃO POR ANTISORO ..............................................................................................................30 PURIFICAÇÃO DE TOXINAS.......................................................................................................................31 OBJETIVOS........................................................................................................................................ 32 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................................... 33 REAGENTES .............................................................................................................................................33 ANIMAIS .................................................................................................................................................33 HISTOLOGIA ...........................................................................................................................................34 CARACTERIZAÇÃO DA PEÇONHA ............................................................................................................36 ENSAIOS IMUNOLÓGICOS ........................................................................................................................40 ATIVIDADES BIOLÓGICAS E PREPARAÇÕES FARMACOLÓGICAS ..................................................................41 RESULTADOS ..................................................................................................................................... 47 INSTALAÇÃO DO BIOTÉRIO DE ARTRÓPODES ..............................................................................................47 DESCRIÇÃO ESTRUTURAL E ULTRAESTRUTURAL DO APARATO VENENÍFERO .....................................................48 EXTRAÇÃO DA PEÇONHA ........................................................................................................................66 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA..............................................................................................68 ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ........................................................................................................................68 CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA ..........................................................................................................70 ATIVIDADES BIOLÓGICAS .........................................................................................................................71 FRACIONAMENTO DA PEÇONHA POR CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA .................................................80 IDENTIFICAÇÃO DAS FRAÇÕES ATIVAS DA PEÇONHA .................................................................................82 DISCUSSÃO....................................................................................................................................... 85 GLÂNDULA E APARATO VENENÍFERO ........................................................................................................85 EXTRAÇÃO DA PEÇONHA ........................................................................................................................88 CARACTERIZAÇÃO DA PEÇONHA ............................................................................................................90 ATIVIDADES BIOLÓGICAS .........................................................................................................................92 CONCLUSÕES................................................................................................................................... 99 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 100 6 ABREVIATURAS 5-HT : 5-Hidroxitriptamina ou serotonina, Ach : Acetilcolina, ANOVA : Análise de variância, ASIC : Canais de sódio sensíveis à acidez (do inglês, acid-sensitive ion channel ), CCVD : Canais de cálcio voltagem-dependentes, CIAE : Canais iônicos ativados por estiramento, E.P.M : Erro padrão da média. ELISA : Ensaio enzimático de immunização (do inglês, enzyme-linked immuno sorbent assay ), HE : Hematoxilina-eosina, HPLC : Cromatografia líquida de alta performance (do inglês, high performance liquid chromatography ), IgG : Imunoglobulina G, Kv : Canais de potássio-voltagem dependente. L-NAME : L-Nitro-arginina-metil-éster, MALDI-TOF : Espectrometria de massa (do inglês, matrix assisted laser dissociation- ionization time of flight ), MET : Microscopia eletrônica de transmissão. MEV : Microscopia eletrônica de varredura. MTT : Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio, Nav : Canais de sódio voltagem-dependentes, OPD : o-Fenilenodiamina. PAS : Coloração histológica ácido periódico– corante de Schiff, PBS : Solução tamponante de fosfato salina (do inglês, phosphate-buffered saline ), REL : Retículo endoplasmático liso. RER : Retículo endoplasmático rugoso. SDS : Dodecil sulfato de sódio. SDS-PAGE : Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida ( do inglês, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ), TRU: Unidade relativa de turbidez (do inglês, turbidity reducing unit ), TTX: Tetrodotoxina. 7 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 – Esquemas do critério de divisão de subordens em Araneae. 16 Figura 2 – Exemplares de Vitalius dubius e biogeografia do gênero Vitalius . 17 Figura 3 – Macho adulto de V. dubius anestesiado, posicionado para extração da 37 peçonha. Figura 4 – Biotério das aranhas no laboratório. 48 Figura 5 – Vista frontal da aranha para localização das quelíceras e ferrões. Foto lateral 49 de uma quelícera isolada. Figura 6 – Eletromicrografia de varredura da quelícera de V. dubius isolada de uma 50 exúvia (exoesqueleto resultante de uma ecdise).