CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS ÁREA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL (MODALIDAD TRADICIONAL) TESIS “GENERACIÓN, CULTIVO Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE PRINCIPIOS ACTIVOS EN RAÍCES TRANSFORMADAS DE SIETE PLANTAS MEDICINALES DEL ESTADO DE ZACATECAS” Presenta BECKY EUNICE TORRES GARCÍA Para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas en el Área de Biotecnología Vegetal TUTOR DR. EUGENIO MARTÍN PÉREZ MOLPHE-BALCH INTEGRANTES DEL COMITÉ TUTORAL DR. SAÚL FRAIRE VELÁZQUEZ DR. JOSÉ FRANCISCO MORALES DOMÍNGUEZ Aguascalientes, Ags., a 05 de abril de 2018. M. EN C. JOSÉ DE JESÚS RUÍZ GALLEGOS DECANO (A) DEL CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS P R E S E N T E Por medio del presente como Tutor designado de la estudiante BECKY EUNICE TORRES GARCÍA con ID 115764 quien realizó la tesis titulada: GENERACIÓN, CULTIVO Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE PRINCIPIOS ACTIVOS EN RAÍCES TRANSFORMADAS DE SIETE PLANTAS MEDICINALES DEL ESTADO DE ZACATECAS, y con fundamento en el Artículo 175, Apartado II del Reglamento General de Docencia, me permito emitir el VOTO APROBATORIO, para que ella pueda proceder a imprimirla, y así como continuar con el procedimiento administrativo para la obtención del grado. Pongo lo anterior a su digna consideración y sin otro particular por el momento, me permito enviarle un cordial saludo. A T E N T A M E N T E “Se Lumen Proferre” Aguascalientes, Ags., a 15 de Noviembre de 2017 Dr. Eugenio Pérez Molphe Balch Tutor de tesis c.c.p.- Interesado c.c.p.- Secretaría de Investigación y Posgrado c.c.p.- Jefatura del Depto. de Química c.c.p.- Consejero Académico c.c.p.- Secretario Técnico M. EN C. JOSÉ DE JESÚS RUÍZ GALLEGOS DECANO DEL CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS P R E S E N T E Por medio del presente como Miembro del Comité Tutoral designado de la estudiante BECKY EUNICE TORRES GARCÍA con ID 115764 quien realizó la tesis titulada: GENERACIÓN, CULTIVO Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE PRINCIPIOS ACTIVOS EN RAÍCES TRANSFORMADAS DE SIETE PLANTAS MEDICINALES DEL ESTADO DE ZACATECAS, y con fundamento en el Artículo 175, Apartado II del Reglamento General de Docencia, me permito emitir el VOTO APROBATORIO, para que ella pueda proceder a imprimirla, y así como continuar con el procedimiento administrativo para la obtención del grado. Pongo lo anterior a su digna consideración y sin otro particular por el momento, me permito enviarle un cordial saludo. A T E N T A M E N T E "Se Lumen Proferre" Aguascalientes, Ags., a 15 de noviembre de 2017. Dr. Saúl Fraire Velázquez Miembro del Comité Tutoral c.c.p.- Interesado c.c.p.- Secretaría de Investigación y Posgrado c.c.p.- Jefatura del Depto. de Química c.c.p.- Consejero Académico c.c.p.- Secretario Técnico AGRADECIMIENTOS A CONACyT, por la beca otorgada para la realización de los estudios de doctorado (registro CVU: 264790). A la Universidad Autónoma de Aguascalientes, por el apoyo financero para la compra de rectivos, materiales, etc. mediante el proyecto PIBT15-2 a cargo de la M. en C. Ma. de Lourdes de la Rosa Carrillo; así como de las instalaciones. Al Dr. Eugenio Martín Pérez Molphe Balch, por todo el conocimiento brindado, por su dedicación y por todo el apoyo para la realización del presente proyecto. Al Dr. José Francisco Morales Domínguez, por todos sus consejos, y por la disponibilidad que siempre mostró para ayudarme en la parte práctica y en las revisiones de los escritos derivados del proyecto. Al Dr. Saúl Fraire Velázquez, por la donación de dos de las tres bacterias empleadas en el proyecto, así como por todos sus consejos, su conocimiento compartido y su gran apoyo. A la Ing. Martha Elvia, porque gracias a toda la ayuda brindada en el laboratorio, fue posible la realización del proyecto. Gracias por compartirme sus conocimientos, por su dedicación, paciencia y su amistad A Isaac, por apoyarme en el cuidado de las plantas aclimatadas en el invernadero, y por su amistad. A la Dra. Angélica Hernández Quintero, por los conocimientos compartidos para la realización de la parte estadística del proyecto. A Alejandra, Shantal y Adilene, por brindarme su sincera amistad, su alegría, su apoyo, haciendo que tanto el cambio de residencia como el trabajo en la Universidad fueran más ligeros y agradables. Siempre estarán en mi corazón. Gracias por todo, chicas. A los compañeros del Laboratorio de Biotecnología Vegetal, por compartirme su tiempo, sus consejos y su alegría. A toda mi familia, Noé, Ari, Fani, mis papás, mis suegros, Maru y Javier, por toda su inigualable ayuda, su apoyo incondicional, por su paciencia, sus consejos y su gran amor, y por creer y confiar siempre en mí. DEDICATORIAS A mi Cielo No hay suficientes palabras para agradecerte por cada uno de los momentos que hemos pasado juntos. Eres el oxígeno que me hace respirar día con día. Gracias por tu amor incondicional, por estar ahí siempre que lo necesito. Gracias por ser mi amigo y compañero en esta vida, por ser el gran pilar de nuestra hermosa familia. Gracias por creer en mí siempre y por amarme siempre. TE AMO… por toda una eternidad… A Ari y Fani Mis pequeñas, lindas y hermosas princesas, por su comprensión y gran amor que me demuestran día con día. Por todas sus enseñanzas, su alegría y sus apapachos. Gracias por ser mi fortaleza. A mi papi Milo y a mi mami Bety Por el apoyo que en todo momento me brindan. Gracias por ser el mejor ejemplo de superación, por todo su amor y sus consejos, y por creer en mí siempre. A mis suegros Chuy y Francisco Por el poyo que siempre me han brindado, su confianza y bendiciones. A Dios Gracias, mil gracias por todo. INDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................ 11 2. ANTECEDENTES ......................................................................... 12 2.1. Medicina Tradicional ................................................................ 12 2.2. Medicina Tradicional en México ................................................. 14 2.3. Importancia del estudio de las plantas medicinales ...................... 15 2.4. Biotecnología aplicada al estudio de plantas medicinales .............. 16 2.5. Generación de raíces transformadas mediante Agrobacterium rhizogenes ........................................................................................ 18 2.5.1. Clasificación de la especie Agrobacterium rhizogenes ................ 18 2.5.2. Proceso de transformación genética mediante A. rhizogenes ...... 20 2.5.3. Características de las raíces transformadas .............................. 25 2.5.4. Obtención de metabolitos secundarios a partir de raíces transformadas ................................................................................. 26 2.5.5. Cepas de interés .................................................................. 27 2.6. Fitoquímicos de interés ............................................................ 31 2.7. Plantas medicinales de interés de la región de Zacatecas ............. 40 2.7.1. Bidens odorata Cav. .............................................................. 41 2.7.2. Chenopodium album L. ......................................................... 43 2.7.3. Chenopodium graveolens Lag................................................. 45 2.7.4. Cucurbita foetidissima H. B. Kunth.......................................... 47 2.7.5. Eysenhardtia polystachya (Ortega) Sarg. ................................. 50 2.7.6. Jatropha dioica Sessé ex. Cerv. .............................................. 53 2.7.7. Lepidium virginicum L. .......................................................... 56 3. JUSTIFICACIÓN ......................................................................... 59 4. HIPÓTESIS ................................................................................ 61 5. OBJETIVOS ................................................................................ 61 5.1. Objetivo general ..................................................................... 61 5.2. Objetivos específicos ............................................................... 61 5.3. Metas .................................................................................... 62 6. METODOLOGÍA .......................................................................... 63 1 6.1. Material vegetal ...................................................................... 64 6.2. Obtención de plantas axénicas .................................................. 64 6.2.1. Pruebas de desinfección y germinación de semillas ................... 64 6.2.2. Cultivo de semillas en condiciones axénicas ............................. 65 6.3. Micropropagación de plantas axénicas ........................................ 65 6.4. Cepas de Agrobacterium rhizogenes .......................................... 67 6.4.1. Cultivo de cepas bacterianas en medio líquido .......................... 67 6.4.2. Inserción del vector pCAMBIA en cepa ARqua1 ......................... 68 6.4.3. Detección de genes de interés en cepas bacterianas ................. 69 6.5. Transformación genética mediada por cepas de A. rhizogenes ...... 70 6.6. Detección de genes de interés en raíces presuntamente transformadas ................................................................................... 72 6.7. Establecimiento de cultivos de raíces transformadas y cuantificación de biomasa ....................................................................................... 73 6.8. Análisis preliminar de principios activos de raíces transformadas ... 75 6.8.1. Preparación del extracto del material vegetal ........................... 75 6.8.2. Análisis preliminar