Institut für Biochemie und Biologie Arbeitsgruppe Pflanzenmetabolismus Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades "Doctor rerum naturalium" (Dr. rer. nat.) in der Wissenschaftsdisziplin "Molekulare Pflanzenphysiologie" eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Potsdam von Madlen Nietzsche Potsdam, April 2016 Teile dieser Arbeit sind in folgenden Publikationen enthalten: Nietzsche, M., Schießl, I., Börnke, F. (2014) The complex becomes more complex: protein- protein interactions of SnRK1 with DUF581 family proteins provide a framework for cell- and stimulus type-specific SnRK1 signaling in plants. Frontiers in Plant Science 5:54 Nietzsche, M., Landgraf, R., Tohge, T., Börnke, F. (2016) A protein-protein interaction network linking the energy-sensor kinase SnRK1 to multiple signaling pathways in Arabidopsis thaliana. Current Plant Biology 5:36-44 Online veröffentlicht auf dem Publikationsserver der Universität Potsdam: URN urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis…………………………………………………………...……………………........i Abkürzungsverzeichnis……………………………………………………...…………………….....iii Abbildungsverzeichnis……………………………………………………...……………………......iv Tabellenverzeichnis…………………………………………………….…...…………………….....vi Zusammenfassung……………………………………………………………………...……….…....1 Summary…………………………………………………………………………..............................3 1 Einleitung ....................................................................................................................... 5 1.1 Energie-/Zuckersensoren in Pflanzen ...................................................................... 5 1.1.1 Glucosesensoren ............................................................................................. 6 1.1.2 Weitere Energiesensoren ................................................................................. 8 1.2 Die SNF1/AMPK/SnRK1 Proteinfamilie ..................................................................11 1.2.1 Aufbau des Komplexes ...................................................................................11 1.2.2 Regulation der SNF1, AMPK und der SnRK1 ..................................................13 1.2.3 Biologische Prozesse an denen die SnRK1 beteiligt ist ...................................20 1.2.4 Bekannte Zielprotein der SnRK1 .....................................................................23 1.3 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................27 2 Material und Methoden ..................................................................................................28 2.1 Material ..................................................................................................................28 2.1.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien ..........................................28 2.1.2 Oligonukleotide, Vektoren und Sequenzierungen ............................................28 2.1.3 Antikörper ........................................................................................................28 2.1.4 Bakterienstämme ............................................................................................29 2.1.5 Hefestämme ....................................................................................................29 2.1.6 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen ....................................................29 2.2 Methoden ...............................................................................................................31 2.2.1 Pflanzentransformation ...................................................................................31 2.2.2 Mikrobiologische Methoden .............................................................................32 2.2.3 Molekularbiologische Methoden ......................................................................34 2.2.4 Biochemische und physiologische Methoden ..................................................38 2.2.5 Mikroskopische Methoden ...............................................................................45 3 Ergebnisse ....................................................................................................................46 3.1 Identifizierung von Interaktionspartnern der A. thaliana SnRK1α-Untereinheiten ......... AKIN10 und AKIN11 .................................................................................................46 3.1.1 SnRK1α-Untereinheiten interagieren in Hefe mit Proteinen der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie ..................................................48 3.1.2 Die DUF581-Domäne ist ausreichend und notwendig für die Interaktion mit SnRK1.............................................................................................................52 i Inhaltsverzeichnis 3.1.3 Lokalisierung von DUF581-Proteinen in N. benthamiana ................................55 3.1.4 Die Ko-Expression mit DUF581-Proteinen beeinflusst die Lokalisierung von AKIN10............................................................................................................56 3.1.5 Interaktionsnachweis von SnRK1α-Untereinheiten und DUF581-Proteinen in planta ..........................................................................................................58 3.2 Identifizierung von Interaktionspartnern der A. thaliana DUF581-Proteinfamilie .....60 3.2.1 DUF581-2 interagiert mit den DELLA-Proteinen GAI und RGA in Hefe und in planta ..........................................................................................................64 3.3 AKIN10/AKIN11 und DUF581-18 haben STKR1 als gemeinsamen Interaktionspartner ....................................................................................................66 3.3.1 Lokalisierung von STKR1 in N. benthamiana ..................................................70 3.3.2 In planta-Interaktionsnachweis von AKIN10 und STKR1 .................................71 3.3.3 Die STKR1-Proteinmenge wird durch AKIN10 stabilisiert ................................72 3.3.4 Studien zur Phosphorylierung von STKR1 ......................................................73 3.4 Herstellung und Analyse von A. thaliana-Pflanzen mit veränderter STKR1-Expression....................................................................................................80 3.4.1 Herstellung von STKR1-überexprimierenden A. thaliana-Linien ......................81 3.4.2 Genotypisierung einer stkr1 T-DNA-Insertionsmutante ....................................81 3.4.3 Analyse von A. thaliana-Pflanzen mit veränderter STKR1-Expression ............82 4 Diskussion .....................................................................................................................99 4.1 Identifizierung neuer SnRK1-interagierender Proteine als mögliche Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion ..................................................................................99 4.1.1 SnRK1-Untereinheiten interagieren mit DUF581-Proteinen ........................... 101 4.2 Identifizierung von Interaktionspartnern der DUF581-Proteine ............................. 105 4.3 AKIN10 und DUF581-Protein haben gemeinsame Interaktionspartner ................. 110 4.4 STKR1, ein gemeinsamer Interaktionspartner von DUF581-18 und SnRK1α- Untereinheiten in Arabidopsis ................................................................................. 112 4.4.1 STKR1 ist ein Phosphoprotein mit potentiellen SnRK1-Zielmotiven .............. 113 4.4.2 STKR1 beeinflusst das Wachstum und die Entwicklung in A. thaliana .......... 117 4.4.3 Mögliche Korrelation des Wachstumsphänotyps durch STKR1- Überexpression mit dem Kohlenhydratmetabolismus .................................... 119 4.4.4 Transkriptionelle Analyse von STKR1-überexprimierenden Pflanzen ............ 121 5 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 126 6 Anhang ........................................................................................................................ 145 ii Abkürzungsverzeichnis ABA Abscisinsäure AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bp Basenpaare BiFC Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation bzw. beziehungsweise ca. circa CaMV Cauliflower Mosaic Virus (Blumenkohlmosaikvirus) Col-0 Columbia DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli ETI Effector Triggered Immunity Fg Frischgewicht GA Gibberellinsäure/Gibberelline GFP grün-fluoreszierendes Protein GO Gene Ontology GST Glutathion-S-Transferase HIS3 Imidazolglycerol-Phosphat-Dehydratase JA Jasmonsäure kDa Kilodalton KLSM Konfokales Laserscanning Mikroskop KT Kurztag LacZ ß-Galactosidase LT Langtag MBP Maltose-Bindeprotein MeJa Methyljasmonat NAD Nikotinamidadenindinukleotid N. benthamiana Nicotiana benthamiana oD600 optische Dichte bei 600 nm PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern PCR Polymerase Chain Reaction PR Pathogenesis Related PTI PAMP-Triggered Immunity RNA Ribonukleinsäure ROS reactive oxygene species SA Salicylsäure SAR systemic acquired resistance S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) Upm Umdrehungen pro Minute YFP gelb-fluoreszierendes Protein iii Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Regulation des SnRK1-Komplexes. ............................................................20