Université de Sherbrooke Caractérisation de l’internalisation constitutive du récepteur aux opioïdes de type delta Par Sébastien Grastilleur Programme de physiologie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en physiologie Sherbrooke, Québec, Canada Novembre, 2019 Membres du jury d’évaluation Ahmed Chraïbi Ph.D; Programme de physiologie, président du jury Louis Gendron Ph.D; Programme de physiologie, directeur de recherche Christine Lavoie Ph.D; Programme de pharmacologie, co-directrice de recherche Stéphane Laporte Ph.D; Department of Endocrinology & Metabolism, McGill University, évaluateur externe à l’Université de Sherbrooke Steve Jean Ph.D; Département d’anatomie, évaluateur externe au programme © Grastilleur Sébastien, 2019 À mes proches et à Valmy Vérité. « Impossible est un mot difficile à prononcer pour un scientifique ». Yves Coppens iii Résumé Caractérisation de l’internalisation constitutive du récepteur aux opioïdes de type delta Par Sébastien Grastilleur Programme de physiologie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en physiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 Le récepteur opioïde delta (DOP), un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), est impliqué dans la régulation de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques (nociception, anxiété, dépression, etc.). En ce sens, il suscite de plus en plus d’intérêt de la part du milieu académique et des compagnies pharmaceutiques. DOP est exprimé de façon ubiquitaire mais est essentiellement présent à l’intérieur des cellules avec une faible expression à la surface cellulaire. Cette localisation particulière pourrait expliquer pourquoi les agonistes du DOP génèrent peu d'effets analgésiques in vivo. Toutefois, il est possible sous certaines conditions (inflammation ou traitement chronique à la morphine) de potentialiser les effets de ces agonistes chez l’animal. Ces effets s’accompagnent d’une augmentation de la densité du récepteur à la surface des cellules. Bien que DOP soit internalisé suivant son activation par un agoniste, il a été observé qu’il était également constitutivement internalisé dans les cellules. Cependant, la caractérisation et régulation de cette voie d’internalisation de DOP est encore peu décrite. Dans le cadre de mes travaux, nous proposons l’hypothèse que l’internalisation constitutive serait un mécanisme capable de moduler l’expression de DOP à la surface cellulaire. Dans des cellules HEK293, exprimant de façon stable Flag DOP, nous avons tout d’abords confirmé l’internalisation constitutive du récepteur. Des expériences d'immunofluorescences avec des marqueurs de Rab ont montré qu’après son internalisation, DOP colocaliserait avec des marqueurs d’endosome précoce Rab5 et de recyclage rapide Rab4. De plus, des co-immunoprécipitations ont révélé une possible interaction entre DOP et ces Rab. D’autre part, l’utilisation d’un mutant inactif de Rab5 a montré une altération de l’internalisation du DOP. Ces résultats suggèrent que l’internalisation constitutive du DOP serait Rab5-dépendante. Enfin, les niveaux de DOP à la surface des cellules ont été diminués à la suite de la déplétion de Rab4A par un DsiARN, suggérant un recyclage constitutif Rab4- dépendant. La déplétion de Rab4A atténuerait également la signalisation du DOP à la suite de son activation par un agoniste. En parallèle, pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction du DOP, nous avons utilisé la technologie de biotinylation de proximité (Bio- ID) par la biotine ligase BirA*. De nombreux candidats ont pu ainsi être identifiés. À plus long terme, nos résultats pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour limiter l’internalisation ou augmenter le recyclage constitutif du DOP. Cela permettrait d’augmenter les niveaux membranaires du DOP et ainsi potentialiser les effets des agonistes delta dans le traitement de pathologies, incluant le traitement de la douleur. Mots clés : DOP, Rab5, Rab4, internalisation et recyclage constitutif, Bio-ID. iv Summary Characterization of delta opioid receptor, DOP, constitutive internalization By Sébastien Grastilleur Physiology program Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for the obtention of Doctor degree diploma philosophiae doctor (Ph.D.) in physiology, Faculty of medicine and health sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 The delta opioid receptor (DOP), a G protein-coupled receptor (GPCR) is involved in the regulation of many physiological and physio-pathological processes (nociception, stress response, neuroprotection, neurodegenerative diseases, anxiety, depression, etc.) and thus raises more and more interest from academia and pharmaceutical companies. DOP is ubiquitously expressed but mainly localized to intracellular sites, with only a small subset expressed at the cell surface. This specific localization could explain why DOP agonists generate few analgesics effects in vivo. On the other hand, it is possible, under certain conditions (inflammation or chronic treatment with morphine) to potentiate the effects of DOP agonists in animals. This effect was paralleled by an increased density of DOP at the plasma membrane. In addition to the agonist-induced internalization, DOP was previously shown to be constitutively internalized. However, the mechanisms involved in this internalization pathway of DOP is still poorly characterized. In the current study, we investigated and characterized the constitutive internalization of DOP as a potential mechanism controlling its cell surface expression. In HEK293 cells stably expressing Flag-tagged DOP, we first confirmed that DOP is constitutively internalized. Immunofluorescence experiments with selected Rab protein markers indicated that internalized DOP was mainly co-localized with the early endosome marker Rab5 and the rapid recycling endosome marker Rab4. Co-immunoprecipitation assays revealed a potential interaction between DOP and these two Rab proteins. Transfection with Rab5 dominant negative mutant inhibits the internalization of DOP. These results indicate that constitutive endocytosis is Rab5-dependent. Furthermore, DOP cell surface expression was strongly reduced following Rab4A DsiRNA treatment, indicating that DOP constitutive recycling is Rab4-dependent. Rab4A depletion also attenuates agonist-induced DOP signaling. In parallel, we used a proximity-dependent biotinylation (Bio-ID) approach with BirA* to identify novel partners of DOP. Many candidates have been identified. In the long term, our results could allow the development of new strategies to limit constitutive internalization or increase constitutive recycling of DOP. This would increase the cell-surface levels of DOP and thus potentiate the effects of DOP agonists in the treatment of pathologies, including pain management. Keywords: DOP, Rab5, Rab4, constitutive internalization and recycling, Bio-ID. v TABLE DES MATIERES Résumé .................................................................................................................................. iv Summary ................................................................................................................................ v Liste des figures ..................................................................................................................... x Liste des tableaux ................................................................................................................. xi Liste des abréviations ........................................................................................................ xii Introduction ........................................................................................................................... 1 Le système opioïdergique. ................................................................................................ 2 Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). .......................................................... 2 Les protéines G hétérotrimériques. ................................................................................. 4 Les protéines Gαs. ......................................................................................................... 6 Les protéines Gαi. ......................................................................................................... 7 Les protéines Gαq. ......................................................................................................... 7 Les protéines Gα12/13. .................................................................................................... 8 Le complexe Gβγ. .......................................................................................................... 8 Les récepteurs aux opioïdes. ............................................................................................ 9 Le récepteur mu, MOP. .............................................................................................. 11 Le récepteur kappa, KOP. ......................................................................................... 12 Le récepteur delta, DOP. ............................................................................................ 13 Régulation du récepteur aux opioïdes de type delta, DOP. ........................................ 16 Modifications