The Use of Purple Nonsulfur Photosynthetic Bacteria to Maintain Water Quality, Sources of Single Cell Protein and Bioactive Compounds for Shrimp Cultivation Supaporn Chumpol A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Microbiology Prince of Songkla University 2017 Copyright of Prince of Songkla University i The Use of Purple Nonsulfur Photosynthetic Bacteria to Maintain Water Quality, Sources of Single Cell Protein and Bioactive Compounds for Shrimp Cultivation Supaporn Chumpol A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Microbiology Prince of Songkla University 2017 Copyright of Prince of Songkla University ii Thesis Title The Use of Purple Nonsulfur Photosynthetic Bacteria to Maintain Water Quality, Sources of Single Cell Protein and Bioactive Compounds for Shrimp Cultivation Author Miss Supaporn Chumpol Major Program Microbiology Major Advisor Examining Committee: ........................................................ ..........................................Chairperson (Prof. Dr. Duangporn Kantachote) (Dr. Ampaitip Sukhoom) Co-advisor ............................................Committee (Prof. Dr. Duangporn Kantachote) ........................................................ (Prof. Dr. Hiroshi Kanzaki) ............................................Committee (Prof. Dr. Hiroshi Kanzaki) ........................................................ (Assoc. Prof. Dr. Teruhiko Nitoda) ............................................Committee ........................................................ (Asst. Prof. Dr. Nugul Intrasungkha) (Dr. Pattamarat Rattanachuay) ............................................Committee (Dr. Pattamarat Rattanachuay) The Graduate School, Prince of Songkla University, has approved this thesis as fulfillment of the requirements for the Doctor of Philosophy Degree in Microbiology .......................................................... (Assoc. Prof. Dr. Teerapol Srichana) Dean of Graduate School iii This is to certify that the work here submitted is the result of the candidate’s own investigations. Due acknowledgement has been made of any assistance received. ...............................................Signature (Prof. Dr. Duangporn Kantachote) Major Advisor ...............................................Signature (Miss Supaporn Chumpol) Candidate iv I hereby certify that this work has not been accepted in substance for any degree, and is not being currently submitted in candidature for any degree. ..............................................Signature (Miss Supaporn Chumpol) Candidate v ชื่อวิทยานิพนธ์ การใชแ้ บคทีเรียสงั เคราะห์แสงสีม่วงที่ไม่สะสมซลั เฟอร์เพื่อรักษาคุณภาพ น้า เป็นแหล่งโปรตีนเซลล์เดียว และสารออกฤทธ์ิทางชีวภาพในการเล้ียงกงุ้ ผู้เขียน นางสาวสุภาภรณ์ ชุมพล สาขาวิชา จุลชีววิทยา ปีการศึกษา 2560 บทคัดย่อ การศึกษาน้ีไดแ้ ยกแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงที่ไม่สะสมซลั เฟอร์ (Purple Nonsulfur Bacteria; PNSB) ซ่ึงเป็นแบคทีเรียที่มีประโยชน์ จากบ่อเล้ียงกุง้ ในหลายพ้ืนที่ภาคใต้ของประเทศ ไทยเพื่อนามาคัดเลือก หาสายพนั ธุ์ที่เด่นเพื่อนา ไปใชใ้ นการเพาะเล้ียงกงุ้ จาก PNSB จานวน 185 สาย พันธุ์ที่แยกได้ เมื่อนา มาทดสอบคุณสมบตั ิความเป็นโปรไบโอติกส์ในหลอดทดลอง พบวา่ มีเพียง 4 สายพันธุ์ ไดแ้ ก่ SS15/ S3W10/ TKW17 และ STW181 ที่มีความสามารถสูงในการผลิตเอนไซม์ ยอ่ ยอาหาร การผลิตวิตามินบี 12 และการสร้างสารยบั ย้งั เช้ือก่อโรคในกลุ่มวิบริโอ ผลการระบุสาย พันธุ์ของเช้ือที่คดั เลือกไดพ้ บว่าสายพันธุ์ SS15/ S3W10 และ TKW17 คือ Rhodobacter sphaeroides ส่วนสายพันธุ์ STW181 คือ Afifella marina ไดน้ า เช้ือดงั กล่าวมาตรวจสอบความเป็น โปรไบโอติกส์ในกุง้ ขาว (Litopenaeus vannamei) ระยะวยั อ่อน โดยใช้ในรูปเช้ือผสม (แต่ละสาย พันธุ์ใช้ 1 × 108 เซลลต์ ่อมิลลิลิตร) 3 ชุดการทดลองคือ T1 (S3W10+SS15) T2 (S3W10+TKW17) และ T3 (S3W10+STW181) โดยเติมลงไปในน้า เล้ียงกุง้ ขาว ทุกสัปดาห์ (1-7) และเพาะเล้ียงเป็น เวลา 60 วัน จากน้นั ทดสอบความตา้ นทานของกุง้ ต่อโรคตบั วายเฉียบพลัน (AHPND) โดยการเติม Vibrio parahaemolyticus SR2 ที่ความเข้มข้น 4 x 104 เซลลต์ ่อมิลลิลิตร และเล้ียงต่อเป็นเวลา 10 วัน พบว่าท้งั 3 ชุดการทดลองที่เติม PNSB กุง้ มีกิจกรรมเอนไซมย์ อ่ ยอาหารสูงข้ึนและเจริญเติบโต เพ่ิมข้ึนอยา่ งมีนยั สา คญั ทางสถิติ โดย PNSB สามารถเพ่ิมจา นวนในทางเดินอาหารของกุง้ ได ้ แมว้ า่ การอยรู่ อดของกุง้ ไม่แตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สา คญั ทางสถิติ อยา่ งไรก็ตามการตายของกุง้ ที่ได้รับสาย พันธุ์รุนแรง AHPND (V. parahaemolyticus SR2) ลดลงมากในทุกชุดการทดลองที่เติม PNSB โดย vi พบวา่ กุง้ ตาย 40% ในชุดควบคุม ขณะที่ในชุดการทดลอง T1 T3 และ T2 ตาย 21% 24% และ 32% ตามลาดับ นอกจากน้ียงั ศึกษาความสามารถในการควบคุมคุณภาพน้า โดยใช้โปรไบโอติกส์ PNSB ในรูปแบบผสมอตั ราส่วน 1:1 เช่นเดียวกบั การทดลองก่อนหนา้ น้ี พบวา่ ตลอด 8 สัปดาห์ของการ + เพาะเล้ียงกุง้ ขาว ชุดการทดลอง T1 และ T3 มีประสิทธิภาพในการลดปริมาณ NH4 และส่งเสริม การเจริญเติบโตของกุง้ ไดด้ ีที่สุด ดงั น้นั จึงเลือกใชแ้ บคทีเรีย 3 สายพนั ธุ์ ไดแ้ ก่ SS15/ S3W10 และ STW181 (แต่ละสายพันธุ์ใช้ 1 × 108 เซลลต์ ่อมิลลิลิตร) โดยเติมลงไปในน้า เล้ียงกุง้ เพื่อทดสอบ ศกั ยภาพในการป้ องกนั การเกิดโรค AHPND ด้วยการเติม V. parahaemolyticus SR2 (1 × 105 เซลล์ ต่อมิลลิลิตร) ในวันที่ 15 ของการเล้ียง ซ่ึงเล้ียงกุง้ เป็นระยะเวลา 30 วัน พบวา่ ชุดที่เติม PNSB อยา่ ง เดียว (ชุดควบคุมทางบวก) และชุดทดสอบที่เติมท้งั PNSB และเช้ือก่อโรคสายพนั ธุ์ SR2 มีคุณภาพ น้า ในการเพาะเล้ียงกุง้ ดีกวา่ ชุดควบคุมที่ไม่เติมเช้ือ (native control) และชุดที่เติมเฉพาะเช้ือก่อโรค SR2 (challenge test) ซึ่งการทดลองน้ียืนยนั ความเป็นโปรไบโอติกส์ของ PNSB ที่สามารถ ครอบครองพ้ืนที่ภายในลา ไส้ของกุ้ง และควบคู่กับการควบคุมคุณภาพน้ าส่งผลให้กุ้งมีการ เจริญเติบโตดีข้ึน และการอยรู่ อดของกุง้ เพ่ิมข้ึน 11% ในชุดการทดลองที่ทา ให้กุง้ รับเช้ือก่อโรค AHPND สายพันธุ์ SR2 สาหรับผลการ ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตสารยบั ย้งั เช้ือวิบริโอของ โปรไบโอติกส์ PNSB (SS15/ TKW17 และ STW181) พบวา่ สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสาร ยบั ย้งั วิบริโอใกลเ้ คียงกับสภาวะที่ใช้ในการเล้ียงกุ้ง สารยบั ย้งั วิบริโอที่ผลิตจาก PNSB มี ส่วนประกอบหลกั เป็นโปรตีน ไขมนั และคาร์โบไฮเดรตที่มีความเสถียรในช่วงค่าที่กวา้ งของ pH และอุณหภูมิซึ่งเหมาะกบั การนา ไปใชใ้ นการเพาะเล้ียงกุง้ สารยบั ย้งั วิบริโอมีฤทธ์ิแบบการฆ่า แบคทีเรียจากหลกั ฐานที่พบวา่ เกิดรูจา นวนมากบนเซลลข์ องเช้ือก่อโรค และยงั พบวา่ มีกิจกรรมที่ทา ให้เซลล์ของเช้ือก่อโรคแตกสลาย การนา สารยบั ย้งั วิบริโอที่ผ่านการทา ให้บริสุทธ์ิของสายพันธุ์ SS15 มาศึกษาลักษณะพบวา่ เป็นสารที่มีขนาดโมเลกุลเลก็ กวา่ 3,000 ดัลตัน โดยมีประจุบวกชนิด weak cation ที่มีหมู่เอมีนเป็นองคป์ ระกอบ นอกจากการใช้ PNSB เป็นโปรไบโอติกส์ยังศึกษา ศักยภาพของ PNSB เพื่อเป็นโปรตีนเซลล์เดียว (single cell protein; SCP) โดยสายพันธุ์ SS15 และ STW181 ถูกคัดเลือกมา ซึ่งพิจารณาจากปริมาณโปรตีน รงควัตถุที่ใช้ในการสังเคราะห์แสง และ กรดอะมิโนที่จา เป็นต่อการเจริญเติบโตของกุง้ นา PNSB ท้งั 2 สายพันธุ์ในรูปไลโอฟิไลซ์ผสมใน อตั ราส่วน 1: 1 และเติมลงในอาหารกงุ้ ทางการค้าคิดเป็น 1% 3% และ 5% ของน้า หนกั อาหารกุง้ ได้ vii อาหารดัดแปลง 3 สูตร ไดแ้ ก่ อาหารสูตรที่ 1 สูตรที่ 2 และสูตรที่ 3 ตามลาดับ เพื่อใชใ้ นการเล้ียงกุง้ + - ต้งั แต่ระยะวยั อ่อนจนถึงกุง้ วยั รุ่นช่วงตน้ ซ่ึงเพาะเล้ียงเป็นเวลา 60 วัน พบวา่ ปริมาณของ NH4 NO2 - NO3 และ COD ในน้า เล้ียงกุง้ ที่ใหอ้ าหารสูตรที่ 2 และ 3 มีค่าสูงกวา่ ชุดควบคุมอยา่ งมีนยั สา คญั ทาง สถิติขณะที่น้า เล้ียงกุง้ จากบ่อที่ใหอ้ าหารสูตรที่ 1 มีค่าพารามิเตอร์ดงั กล่าวต่า ที่สุดเมื่อเทียบกบั ชุดที่ ให้อาหารสูตรดดั แปลงดว้ ยกนั และมีค่าใกลเ้ คียงกบั ชุดควบคุม พบว่าการเจริญเติบโตของกุง้ ที่ให้ อาหารสูตรที่ 1 มีการเจริญเติบโตดีมากกว่ากุง้ ที่ใหอ้ าหารสูตรที่ 2 3 และกุง้ ในชุดควบคุม การอยู่ รอดของกุง้ สูงสุดพบในชุดการทดลองอาหารสูตรที่ 1 เท่ากบั 85% ซ่ึงค่าที่ไดไ้ ม่แตกต่างอยา่ งมี นัยสาคัญ ทางสถิติเมื่อเทียบกบั ชุดการทดลองอื่น ซ่ึงกุง้ ในชุดควบคุมมีการอยรู่ อด เท่ากบั 80% อีก ท้งั ยงั พบว่ากุง้ ในทุกชุดการทดลองที่ให้อาหารสูตรดัดแปลงมีการตอบสนองของระบบภูมิคุม้ กนั สูงข้ึน (ปริมาณเม็ดเลือดรวม และกิจกรรมของเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดส รวมท้งั เอนไซม์ซูเปอร์ ออกไซด์ ดิสมิวเทส) รวมท้งั ผลของเน้ือเยอื่ ตบั และตบั อ่อนของกุง้ (hepatopancreas) ในทุกชุดที่ให้ อาหารสูตรดดั แปลงมีลกั ษณะปกติ ซ่ึงบ่งช้ีวา่ กุง้ มีสุขภาพดี โดยสรุปผลงานวิจยั คร้ังน้ีแสดงใหเ้ ห็น วา่ PNSB ท้งั 4 สายพันธุ์ที่คัดเลือกได้จัดเป็นแบคทีเรียที่มีประโยชน์ที่มีศักยภาพสูงสาหรับ ใช้ใน การเพาะเล้ียงกงุ้ ขาว คาส าคัญ: โปรไบโอติกส์ แบคทีเรียสงั เคราะห์แสงสีม่วงที่ไม่สะสมซลั เฟอร์ การเพาะเล้ียงกงุ้ โปรตีนเซลล์เดียว แบคทีเรียกลุ่มวิบริโอ คุณภาพน้า viii Thesis Title The use of purple nonsulfur photosynthetic bacteria to maintain water quality, sources of single cell protein and bioactive compounds for shrimp cultivation. Author Miss Supaporn Chumpol Major Program Microbiology Academic Year 2017 ABSTRACT Purple nonsulfur bacteria (PNSB) as beneficial bacteria were isolated from various shrimp ponds in Southern Thailand for promising strains selection with the purpose to use them in shrimp cultivation. Among 185 isolated PNSB were screened based on probiotics properties in vitro; there were only 4 strains (SS15, S3W10, TKW17 and STW181) showed strong activities for producing digestive enzymes, vitamin B12 and antivibrio compounds. These selected PNSB were identified as Rhodobacter sphaeroides for strains SS15, S3W10 and TKW17 and Afifella marina for strain STW181. They were proved for their probiotic properties in vivo as a mixed culture (each at 1 × 108 cells mL−1) for 3 sets (T1: S3W10+SS15, T2: S3W10+TKW17 and T3: S3W10+STW181), by inoculating into rearing water of postlarval Litopenaeus vannamei every week (1-7) for 60 days; and then challenge white shrimp with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) causing V. parahaemolyticus SR2 at 4 x 104 cells mL−1 by continuing cultivation for 10 days. All PNSB sets significantly enhanced the digestive enzyme activities and shrimp growth with their proliferation in