UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS, FITOQUÍMICOS E ATIVIDADE ANTILEISHMANIA DE ESPÉCIES Geissospermum (Apocynaceae) João Victor da Silva e Silva Belém-PA 2016 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS, FITOQUÍMICOS E ATIVIDADE ANTILEISHMANIA DE ESPÉCIES Geissospermum (Apocynaceae) Autor: João Victor da Silva e Silva Orientadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Co-orientador: Prof. Dr. Andrey Moacir do Rosario Marinho Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito final para obtenção do Título de mestre em Ciências Farmacêuticas. Belém-PA 2016 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde / UFPA Silva, João Victor da Silva e. Estudos farmacognósticos, fitoquímicos e atividade antileishmania de espécies Geissospermum (Apocynaceae) / João Victor da Silva e Silva; orientadora, Maria Fâni Dolabela, co-orientador, Andrey Moacir do Rosário Marinho. — 2016. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2016. 1. Leishmaniose. 2. Química orgânica (Fitoquímica). 3. Plantas medicinais. 4. G. vellosii. 5. G. sericeum. I. Título. CDD: 22. ed. : 616.9364 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Terezinha Soares da Silva e Sebastião Siqueira da Silva que são a base de tudo em minha vida. AGRADECIMENTOS Ao meu Deus, Jesus Cristo, por me dá capacidade e se fazer presente em todos os momentos de minha vida. À meu alicerce, mãe e pai, que me possibilitaram mesmo na simplicidade de suas condições vê na educação uma ferramenta de transformação e esperança. À toda minha família que apesar da distancia se fizeram presentes em todos os momentos. Fica aqui meus mais sinceros agradecimentos as minhas irmãs Dayana, Danila e Idalina e ao meu irmão João Paulo. Também não posso deixar de agradecer ao meu tio Waldemar e tias Raimunda e Deuza por abriram a porta de suas casas e suas vidas. À minha companheira, pelo carinho de todos os dias, pela cumplicidade, momentos de alegrias e principalmente pelas histórias que estamos escrevendo diariamente juntos... meu muito obrigado a “estrelinha”, Romênia de Freitas. Hoje é mais um desses dias que olho para trás e vejo quanto já cresci pelas oportunidades que minha orientadora me proporcionou. Agradeço por me tornar melhor que ontém e querer ser melhor amanhã, muito obrigado professora Maria Fâni Dolabela. Ao professor Andrey Marinho, pela co-orientação desse trabalho e por todos os momentos que sempre esteve disposto a ajudar. Aos professores que contribuíram com esse trabalho: Fernando Tobias, Lílian Lund, Márlia Coelho, Marta Chagas, José Otávio, Roseane Costa, Sandro Percário. Ao Grupo PET-Farmácia e aos alunos de iniciação científica pela oportunidade de aprender diarimente a capacidade de orientar, obrigado em especial ao Airton Moraes, Alexandre Rosa, Analu Damasceno, Ana Laura, Fernanda Melo, Laisy Trindade, Lara Vinhal, Lindalva Ferreira, Jhéssica Peniche, Juliana Corrêa, Juliana Silvestre, Luiz Antônio, Natasha Cristina e Tatiane Costa. À todos os discentes do PPGCF, agradeço a Andreza Silva (à orientadora), Dayse Brandão (a queridinha), Érica Patrícia (a conterrânea), Érica Vanessa (a namoradinha), Heliton Patrick (o “zerado”), Kelly Albuquerque (a mãezona), Mírian Bastos (a senhorita TOC, viciada em cafeína), Milena Martins (a leitora), Rosana Monteiro (a Rosana IML), Rosana Sarmento (a mellitus), Valdicley Vale (o ex- Padawan). Também quero agradecer aos discentes Everton Varela, Kalene Oliveira, Rafael Quadros, Rafaelli Gomes e Taylon Aguiar por toda ajuda prestada. Aos discentes do laboratório de Química: André, Érica, José Wander e Luciano (PPGQ UFPA); laboratório de toxicologia: Johnatan Azevedo e Lucas Gallat; Museu Paraense Emílio Goeldi: Rafaela Cabral. Ao Jorge Dores Rissino (“seu Jorge”, Laboratório de Citogenética do Instituto de Ciências Biológicas) e ao Raimundo Nonato da Silva Barbosa (“seu Nonato”, Laboratório de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas), pessoas que foram fundamentais para o desenvolvimento desse trabalho. Fica aqui meu muito obrigado! RESUMO SILVA-SILVA, J. V. ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS, FITOQUÍMICOS E ATIVIDADE ANTILEISHMANIA DE ESPÉCIES Geissospermum (Apocynaceae). 141 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2016. O objetivo deste trabalho foi realizar estudos farmacognósticos, fitoquímicos, atividade antileishmania e citotoxicidade de Geissospermum vellosii Allemão e Geissospermum sericeum Miers. Os estudos farmacognósticos foram realizados de acordo com a Farmacopeia Brasileira, V ed. (2010). Os extratos (EEGV e EEGS) foram obtidos através da maceração exaustiva com etanol (96° GL), seguido de concentração em rotaevaporador. O extrato etanólico foi fracionado por dois métodos: extração sob refluxo (frações de diferentes polaridades) e partição ácido- base (fração de neutro e fração acaloídica). As frações alcaloídicas (FAGV e FAGS) foram fracionadas em coluna cromatográfica contendo gel de Sephadex LH-20, e as subfrações resultantes foram analisadas em CCD e reveladas com reagente de Dragendorff e ultravioleta (365 nm). As subfrações F6FAGV e F6FAGS, onde se detectou alcaloides e bom rendimento, foram submetidas a novos fracionamentos em CLAE-DAD semipreparativa e a métodos espectrofotométricos. Na avaliação antileishmania utilizou-se formas promastigotas da espécie de Leishmania amazonensis (5 x 106 parasitas/100µL) tratada com diferentes concentrações das amostras por 24, 48 e 72h. A analise foi feita adicionando-se brometo de [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT) em leitor de ELISA, em 490nm. A citotoxicidade foi avaliada através do ensaio de viabilidade celular com o MTT em células THP-1 diferenciadas e HepG2. Como critério de seleção foi utilizado o cálculo do índice de seletividade (IS), descrito como a razão entre a concentração citotóxica 50% em linhagens celulares e a Concentração inibitória 50% encontrado para protozoários, considerando-se pormissores valores ≥ 10. Os pós das plantas foram classificados como grosso (G. vellosii) e muito grosso (G. sericeum), de baixa densidade, com pH de 4,94 (G. vellosii) e 6,47 (G. sericeum), negativos para saponinas, com teor de cinzas e umidade dentro dos parâmetros estabelecidos pela Farmacopeia Brasileira, V ed. O estudo fitoquímico levou ao isolamento de um alcaloide indólico (F3F6FAGV) e um β-carbolínico (flavopereirina) de ambas as espécies. O fracionamento de EEGV e EEGS resultou em subfrações mais citotóxicas, porém o tempo de exposição e o refracionamento reduziram esta toxicidade. Na avaliação antripromastigota todas as amostras foram ativas e o fracionamento aumentou a atividade. A flavopereirina apresentou atividade tempo dependente e superior a anfotericina B. Entretanto, a associação da flavopereirina com alcaloide indólico e/ou a anfotericina B reduziu a seletividade desse metabólito. O fracionamento dos extratos contribui para elevação do índice de seletividade, sendo a seletividade da flavopereirina elevada (IS= 4893,3). Logo, o isolamento da flavopereirina contribui para redução da citotoxicidade e aumento da seletividade, caracterizando-se como um agente antileishmania promissor. Palavras-chave: Leishmaniose, química orgânica (fitoquímica), plantas medicinais, G. vellosii, G. sericeum. ABSTRACT SILVA-SILVA, J. V. PHARMACOGNOSTIC AND PHYTOCHEMICAL STUDIES, AND ANTILEISHMANIAL ACTIVITY OF Geissospermum SPECIES (APOCYNACEAE). 2016. 141 p. Dissertation (Master’s degree) - Graduate Degree Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pará, Belém, 2016. This study aimed to perform pharmacognostic and phytochemical studies, and assess antileishmanial activity and cytotoxicity of Geissospermum vellosii Allemão and Geissospermum sericeum Miers. The pharmacognostic study was carried out as described in the Brazilian Pharmacopoeia, 2010. The ethanol extracts (GVEE and GSEE) were obtained by exhaustive maceration with ethanol (96 ° GL), followed by concentration in rotaevaporator. The ethanol extract was fractionated using two methods: extraction under reflux (fractions of different polarities) and acid-base partition (neutral and alkaloid fractions). The alkaloid fractions (GVAF and GSAF) were fractionated on a chromatographic column with Sephadex LH-20 gel, and the resulting subfractions were analyzed on TLC, and reveled through Dragendorff reagent and ultraviolet (365 nm). The F6GVAF and F6GSAF subfractions, with alkaloids detected and good yield, were subjected to semi-preparative HPLC-DAD, and spectrophotometric methods. For evaluating the antileishmanial activity, promastigote forms of Leishmania amazonensis at a concentration of 5 x 106 parasites/100μL were treated with the samples at different concentrations for 24, 48 and 72h. The analysis was done adding [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to the samples in an ELISA reader at 490 nm. Cytotoxicity was assessed through cell viability assay with MTT in differentiated THP- 1 cells and HepG2. As a selection criteria, the selectivity index (IS) was calculated as the ratio between the cytotoxic concentration 50% in cell