Sueli Gardim Diagnóstico molecular e relações filogenéticas entre nove espécies de Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) Tese apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP, Câmpus Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. João Aristeu da Rosa ARARAQUARA - SP 2013 Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota. Madre Teresa de Calcuta Todo o argumento permite sempre a discussão de duas teses contrárias, inclusive este de que a tese favorável e contrária são igualmente defensáveis. Protágoras de Abdera Dedico esta Tese... ...aos amores da minha vida! Meu marido Paulo Vitor Esposto Curti pelo apoio e acolhimento em todos os momentos, principalmente nos de incerteza, muito comuns para quem tenta trilhar novos caminhos. Aos meus pais, Rubens Paulo Gardim e Nilce Aparecida Florio Gardim, que dignamente me ensinaram a importância da família e o caminho da honestidade e da persistência. Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena. Agradecimento Ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, pela orientação no desenvolvimento desta Tese, o meu reconhecimento pela oportunidade de realizar este trabalho ao lado de alguém que transpira sabedoria; meu respeito e admiração pela sua serenidade, principalmente nos momentos de ansiedade. Ao senhor, a minha sincera gratidão. Agradecimentos especiais À Deus por me presentear com vida e saúde para concretizar meus ideais. À minha família, em especial às minhas irmãs Nanci Gardim e Marli Gardim, pela paciência, apoio e carinho. Aos melhores amigos do mundo Hebert Fabricio Tortoreli Quadrado, Marco Aurélio Rodrigues, Pedro Luis Faga Celli, Cézar Augusto Tonielo de Alcântara, Adriano Benacci, Daniel Mana, Letícia Carla Gomes e Paloma Pompeu Fusco, representantes das alegrias cotidianas e com presença sempre marcante em minha vida. À vocês meu muito obrigada pela competência em mostrar-me como a vida é maravilhosa ao me proporcionar a honra da (tão acolhedora) companhia de vocês. Aos membros do Laboratório de Parasitologia (FCFAr – UNESP): Às professoras Mara Cristina Pinto e Márcia da Silva Graminha, por dispertar seus alunos para a pesquisa, e pelos ensinamentos e expriências compartilhados. Aos colegas Carlos Eduardo Almeida, Danila Blanco de Carvalho, Eloísa Pinotti, Eder dos Santos Souza, Jader de Oliveira, Patrícia Lopes, Thais Goulart, Cláudia Solano Rocha, Júlio César Miné, Vagner José Mendonça, Aline Rimoldi Ribeiro, assim como, todos que fizeram parte deste grupo de pesquisa, mesmo que temporariamente (estagiários e alunos estrangeiros), agradeço pelo auxílio, amizade e companheirismo. Às técnicas Isabel Martinez e Terezinha Ricci, pelo auxílio com as técnicas laboratoriais que tanto contribuíram para meu crescimento profissional e minha formação. Aos vários colaboradores que possibilitaram e apoiaram o desenvolvimento de um projeto e a concretização de um sonho: À professora Regina Maria Barretto Cicarelli (FCFAr – UNESP) pela solicitude, prontidão e suporte experimental. À Daniela Luz Ambrósio e Marco Túlio Alves da Silva pelo apoio e auxílio intelectual, que (mesmo distantes) sempre foram marcantes no desenvolvimento deste trabalho. Aos servidores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, em especial à Margareti Rossi (Secretaria), em nome de todos os colegas do Departemento de Ciências Biológicas, pelo generoso auxílio sempre que solicitado, e à Cláudia Molina, em nome das colegas da Seção de Pós-Graduação, pelo apoio e prontidão às solicitações. Aos novos colegas de trabalho Adriano Palomino de Oliveira, Beatriz Buda Fuller, Celso Luis Borsato, Donizete Gonçalves de Oliveira e Fernando Luis Capeli, pela dedicação ao ensinar-me um novo ofício, e que, mesmo com as frequentes mudanças nas escalas de trabalho, sempre me apoiaram durante as etapas finais desta Tese. Aos membros participantes da banca avaliadora de defesa desta Tese de Doutorado, Profa. Dra. Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira, Dr. Carlos Eduardo de Almeida, Prof. Dr. Marcos Takashi Obara e Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque pela valiosíssima contribuição para o fechamento da Tese, assim como aos membros suplentes Profa. Regina Maria Baretto Cicarelli, Dr. Walter Ceretti Júnior e Prof. Dr. José Clóvis do Prado Júnior, pela dispinibilidade e solicitude. À vocês o meu reconhecimento e sincero agradecimento pelo incentivo e auxílio durante todas etapas desta Tese. 2GHVHQYROYLPHQWRGHVWDWHVHIRLILQDQFLDGRSHOD )XQGDomRGH$PSDURj3HVTXLVDGR(VWDGRGH6mR3DXOR )$3(63 3URFHVVR LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 12S Fragmento ribossomal menor do DNA mitocondrial 16S Fragmento ribossomal maior do DNA mitocondrial 18S Fragmento ribossomal menor do DNA nuclear 28S Fragmento ribossomal maior do DNA nuclear A Base nitrogenada adenina BPP Probabilidade Posterior na análise Bayesiana C Base nitrogenada citosina COI Fragmento mitocondrial citocromo oxidase I CTA Colônia de Triatomíneos de Araraquara Cytb Fragmento mitocondrial citocromo b D2 Região D2 do fragmento ribossomal maior do DNA nuclear DC Doença de Chagas DNA ácido desoxirribonucléico DNDi Iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas DNTP desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) F1 Universal(G3F1U) Primer senso, que anela para todas as espécies do grupo FCAV Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FCF Faculdade de Ciências Farmacêuticas G Base nitrogenada guanina G1 Grupo composto por R. neglectus, R. robustus, R. prolixus e R. pictipes G2 Grupo composto por T. maculata e T. pseudomaculata G3 Grupo composto por T. tibiamaculata, T. vitticeps e T. melanocephala G3R1Tt Primer anti-senso que anela para Triatoma tibiamaculata G3R2Tt Primer anti-senso que anela para Triatoma tibiamaculata G3R3Tv Primer anti-senso que anela para Triatoma vitticeps G3R4Tm Primer anti-senso que anela para Triatoma melanocephala G3R5Tm Primer anti-senso que anela para Triatoma melanocephala h hora HIV/Aids Síndrome da Inmunodeficiência Adquirida IFSC Instituto de Física de São Carlos ITS1 Espaçador interno transcrito I ITS2 Espaçador interno transcrito II Kb kilobase (1000 bases) Km Kilometro M1, M2 e M3 Populações de Triatoma melanocephala MgCl2 cloreto de magnésio min minuto mM milimolar mtDNA ácido desoxirribonucleico mitocondrial NA Fragmento não adequado ao desenho de primers específicos nDNA ácido desoxirribonucleico nuclear Nested PCR Reação de amplificação em cadeia a partir do produto de outra PCR ng nanograma oC Graus centígrados OMS Organização Mundial da Saúde ONG Organização não governamental P Peso molecular pb Pares de bases PCR Reação de amplificação em cadeia de polimerases de DNA utilizando um par de iniciadores PCR–multiplex Reação de amplificação em cadeia de polimerases de DNA utilizando iniciadores múltiplos pH potencial hidrogeniônico Porcentagem de CG porcentagem de citosina e guanina, grau de ligações de hidrogênio primer F Iniciadores senso (Forward) primer R Iniciadores anti-senso (Reverse) primers Oligonucleotídeos iniciadores de amplificação R6 Universal Primer anti-senso que anela para todas as espécies do grupo Sinan Sistema de Informação de Agravos de Notificação SUS Sistema Único de Saúde T Base nitrogenada timina Tab, Tabs Tabela (s) TM Temperatura na qual metade das moléculas de DNA estão pareadas UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” USP Universidade de São Paulo UV Radiação ultravioleta V volt WHO World Health Organization (Organização Mundial da Saúde) ȝL microlitro LISTA DE FIGURAS Figura 1: Distribuição da DC no mundo, com ênfase na transmissão vetorial da infecção por T. cruzi. Figura 2: Eletroforese em gel de agarose (1%) do DNA genômico extraído de 54 exemplares de Triatominae avaliados. Figura 3: Produto da PCR relativo ao fragmento Cytb com cerca de 750 pb para as espécies R. pictipes (43 e 46); R. neglectus (10-12, 18-20, 24-26, 44 e 45); R. robustus (35-42); T. maculata (01-03, 13-14, 27-28); T. pseudomaculata (04-05, 08-09, 15-16, 21 e 23); T. melanocephala (29-33); T. tibiamaculata (47-49); T. vitticeps (51-53). Figura 4: Produto da PCR relativo ao fragmento 16S com cerda de 450 pb para as espécies R. neglectus (10-12, 18-20, 24-26 e 44); R. pictipes (43 e 46) (A); R. robustus (35-42); T. tibiamaculata (47-50); T. vitticeps (51-54) (B); T. melanocephala (29-34) (C). Figura 5: Produto da PCR de amplificação relativa ao fragmento COI com cerca de 700 pb para as espécies R. pictipes (43 e 46); R. neglectus (10-12, 18-20, 24-26, 44 e 45); R. robustus (35-42); T. maculata (01-03, 13-14, 27-28); T. pseudomaculata (04-09, 15-17, 21- 23); T. melanocephala (29-34); T. tibiamaculata (47-50); T. vitticeps (51-54). Figura 6: Produto da PCR de amplificação relativa ao fragmento ITS1 com cerca de 1.100 pb para as espécies T. maculata (01-03, 13-14, 27-28); T. pseudomaculata (04-09, 16, 17, 21- 23); T. melanocephala (29-34, 43-44); T. tibiamaculata (47-50); T. vitticeps (51-54). Figura 7: Produto da PCR de amplificação relativa ao fragmento ITS2 com cerca de 900 pb para as espécies T. maculata (01-03, 13-14, 27-28); T. pseudomaculata (04-09, 16, 17, 21- 23); T. melanocephala (29-34, 43-44); T. tibiamaculata (47-50); T. vitticeps (51-54). Figura 8: Produto da PCR de amplificação relativa ao fragmento Itm para as espécies T. maculata (01-03, 13-14, 27-28); T. pseudomaculata (04-09, 16, 17, 21-23); T. melanocephala (29-34, 43-44); T. tibiamaculata (47-50); T. vitticeps (51-54). Figura 9: Alinhamento realizado no programa Clustal W das sequências obtidas