LA INHIBICIÓN DE LA GAMMA SECRETASA ALTERA LA EXPRESIÓN DE GENES DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN NOTCH EN EL CISTICERCO DE TAENIA SOLIUM Y REPRIME LA EVAGINACIÓN DEL ESCÓLEX TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR JUAN BLUME LA TORRE LIMA-PERÚ 2020 ASESORA: Cristina Guerra Giraldez, PhD JURADO DE TESIS: Dr. Pablo Tsukayama Cisneros Presidente Dr. Daniel Clark Leza Vocal Mg. Carla Maria Gallo Lopez Aliaga Secretario Dedicatoria Le dedico este trabajo a mi familia por todo su apoyo. Agradecimientos Le agradezco a mi familia por su apoyo incondicional en este camino y por ser un gran soporte. Le agradezco a la Dra. Cristina Guerra por la oportunidad de formar parte de su equipo de laboratorio y por la retroalimentación y críticas constructivas que permitieron que pueda desarrollar los experimentos y la tesis con éxito. Le agradezco a mis compañeros de laboratorio Renzo, Segundo, David, Valeria y Pamela, por el apoyo en los experimentos y por su amistad. Le agradezco a mis amigos del colegio y amigos de la universidad por el ánimo que me dieron y dan para seguir avanzando y por los buenos momentos compartidos. Angela, Stefany y Luis gracias por el soporte brindado Le agradezco al jurado de la tesis por sus críticas constructivas. Financiamiento Este trabajo se realizó con el apoyo del Fondo de entrenamiento NIH Fogarty: “Translational Research Development for Endemic Infectious Diseases of Amazonia”. Grant number: 2D43TW007120-11A1 Índice: RESUMEN ................................................................................................................................. ABSTRACT ................................................................................................................................ INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 1 ESTADO DEL ARTE ................................................................................................................... 2 Taenia solium: Ciclo de vida e importancia en salud pública .................................................................... 2 Neurocisticercosis ....................................................................................................................................... 3 Morfología y desarrollo de T. solium .......................................................................................................... 4 Células proliferativas en platelmintos ............................................................................................................ 6 Modelos in vivo e in vitro ............................................................................................................................... 7 Vía de señalización Notch ........................................................................................................................... 8 Mecanismo “canónico” de la vía Notch ....................................................................................................... 10 Gamma secretasa, sustratos e inhibidores ................................................................................................... 11 Comunicación célula-célula y formación de patrones .................................................................................. 12 Vía Notch en vertebrados e invertebrados ............................................................................................... 13 Vía Notch en platelmintos ............................................................................................................................. 15 HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 17 OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 17 MÉTODOS ............................................................................................................................. 18 Obtención, estabilización y selección de cisticercos de T. solium ............................................................. 18 Cultivo de cisticercos ................................................................................................................................ 19 Soluciones y medio........................................................................................................................................ 19 Condiciones de cultivo .............................................................................................................................. 20 Selección de genes y diseño de primers .................................................................................................... 20 Medición de la expresión relativa ............................................................................................................. 21 Extracción de ARN........................................................................................................................................ 21 Tratamiento con DNAsa I ............................................................................................................................. 22 Transcripción reversa ................................................................................................................................... 22 RT-qPCR ....................................................................................................................................................... 22 Eficiencia de la qPCR ................................................................................................................................... 23 Estabilidad de los genes de referencia ......................................................................................................... 23 Pruebas estadísticas .................................................................................................................................. 23 Aspectos éticos .......................................................................................................................................... 23 RESULTADOS ......................................................................................................................... 24 DAPT inhibió la evaginación in vitro de T. solium ................................................................................... 24 El ácido taurocólico al 0.1% y la tripsina al 0.1% indujeron la evaginación in vitro de los cisticercos... 25 DAPT afectó la expresión de genes Notch a nivel de transcritos ............................................................. 26 El ácido taurocólico indujo la expresión de genes Notch tras 24 horas ................................................... 29 El tratamiento con DAPT no afecta la viabilidad de los cisticercos ......................................................... 30 DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 31 El inhibidor DAPT impidió parcial o totalmente la evaginación de T. solium......................................... 31 El inhibidor afectó la expresión de genes relacionados con la vía Notch ................................................. 32 La evaginación fue inducida con ácido taurocólico y tripsina ................................................................. 34 La expresión de genes hes podría estar asociada a eventos de desarrollo ................................................ 35 No existe un modelo de maduración in vitro de T. solium ........................................................................ 35 LIMITACIONES ....................................................................................................................... 36 DIRECCIÓN A FUTURO ........................................................................................................... 37 CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 39 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 40 ANEXOS .................................................................................................................................... TABLAS Y FIGURAS Tabla 1. Elementos de la vía de señalización Notch 9 Tabla 2. Reacción de RT-qPCR 22 Tabla 3. Porcentaje de evaginación luego de 48 y 120 horas 24 Tabla A1. Genes de T. solium homólogos a genes de H. microstoma Tabla A2. Primers diseñados para genes de T. solium Tabla A3. Eficiencia de qPCR por gen de interés y de referencia Tabla A4. Cuantificación de ARN total del Experimento 1 Tabla A5. Cuantificación de ARN total del Experimento 2 Tabla A6. Análisis por BestKeeper Tabla A7. Comparación de ∆Ct entre genes de referencia candidatos Figura 1. Ciclo de vida de T. solium 3 Figura 2. Filogenia actual de los cestodos 5 Figura 3. Vía de señalización Notch esquematizada 11 Figura 4. Procesos de inducción e inhibición lateral 13 Figura 5. Diseño de cultivo de cisticercos 18 Figura 6. Cisticercos tras 120 horas de cultivo bajo distintas condiciones 25 Figura 7. Cisticercos evaginados tras 120 h de cultivo en distintas condiciones 25 Figura 8. Registro diario de cisticercos que evaginaron el escólex 26 Figura 9. Expresión de los receptores notch1 y notch2 27 Figura 10. Expresión de los receptores delta1 27 Figura 11. Expresión de los componentes de la gamma