CARACTÉRISATION GÉNOTYPIQUE ET PHÉNOTYPIQUE D’ISOLATS DE XANTHOMONAS HORTORUM PV. VITIANS CAUSANT LA TACHE BACTÉRIENNE DE LA LAITUE AU CANADA par Pierre-Olivier Hébert mémoire présenté au Département de biologie en vue de l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) FACULTÉ DES SCIENCES UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE Sherbrooke, Québec, Canada, mai 2019 Le 10 mai 2019 Le jury a accepté le mémoire de Monsieur Pierre-Olivier Hébert dans sa version finale. Membres du jury Professeure Carole Beaulieu Directrice de recherche Département de Biologie, Université de Sherbrooke Docteure Vicky Toussaint Codirectrice de recherche Centre de recherche et de développement de Saint-Jean-sur-Richelieu Docteur Martin Laforest Évaluateur externe Centre de recherche et de développement de Saint-Jean-sur-Richelieu Professeur Kamal Bouarab Président-rapporteur Département de Biologie, Université de Sherbrooke SOMMAIRE Au Canada, la culture de la laitue (Lactica sativa L.) demeure depuis des années un marché très lucratif parmi les autres types de cultures. Étant un légume feuille, tous facteurs biotiques et abiotiques affectant l’aspect, la quantité et la taille des feuilles d’une laitue peuvent compromettre sa valeur marchande. Parmi ces facteurs, les maladies d’origine bactérienne demeurent un enjeu important autant pour les producteurs que pour la communauté scientifique, car la laitue est très sensible à plusieurs produits phytosanitaires. Les pesticides à base de cuivre causent généralement des dommages phytotoxiques aux plants, rendant les traitements contre les agents pathogènes bactériens très difficiles. C’est en effet le cas pour la maladie de la tache bactérienne de la laitue, causée par Xanthomonas hortorum pv. vitians. En 2017, un premier pesticide fut homologué contre cet agent pathogène. Toutefois, l’usage continu du même pesticide peut mener à des cas de résistance, et les traitements chimiques sur la partie consommable du légume demeurent une préoccupation pour le consommateur. Afin de réduire l’incidence de cette maladie, l’alternative la plus prometteuse reste le développement de cultivars tolérants. Par contre, afin de permettre de bien tester la tolérance face à la maladie des nouveaux cultivars développés, une bonne connaissance de la diversité de l’agent pathogène est primordiale. Ainsi, l’objectif de ce projet de recherche était de procéder à une caractérisation génotypique et phénotypique de plusieurs isolats de X. hortorum pv. vitians recueillis dans la principale région productrice de laitue au Canada, d’identifier et de distinguer les pathotypes présents et enfin, de fournir des outils diagnostiques permettant la détection de ces pathotypes, à partir de cultures pures, en utilisant des techniques de qPCR. La réception hebdomadaire d’échantillons de laitues symptomatiques durant les saisons estivales de 2014 à 2017 a supporté la création d’une importante collection d’isolats de X. hortorum pv. vitians purifiés à partir de laitues provenant d’une dizaine de producteurs de la région de la Montérégie. L’extraction de tissus végétaux infectés, la macération dans une solution saline, une sonication et l’étalement sur milieu de culture solide a permis de purifier iv 694 isolats qui ont tous pu être associés au pathovar vitians par amplification PCR et séquençage Sanger de quatre gènes constitutifs. L’inoculation par aspersion de trois cultivars de laitue, classés sensible (Paris Island Cos), intermédiaire (Romora) ou tolérant (Little Gem) à la tache bactérienne, suivie d’une évaluation rigoureuse des symptômes ont permis l’identification de six pathotypes de X. hortorum pv. vitians présents dans la zone de production de laitue de la Montérégie. Ces pathotypes montrent des profils différents de pouvoir pathogène sur les cultivars testés, dont la majorité ne cause pas de symptômes sur le cultivar tolérant. De plus, deux traits phénotypiques ont été étudiés in vitro afin de distinguer les pathotypes. La sécrétion d’un exopolysaccharide, le xanthane, et la production d’un pigment jaune, la xanthomonadine, ont été caractérisées pour plusieurs isolats appartenant aux différents pathotypes. Bien que des taux de sécrétion variables entre pathotypes aient été observés pour chacun des traits phénotypiques étudiés, les résultats semblent indiquer que la caractérisation des productions in vitro de xanthane et de xanthomonadine ne constituerait pas un moyen adéquat pour distinguer ces pathotypes. Afin de caractériser plus en profondeur les pathotypes, des techniques de séquençage de nouvelle génération ont été employés afin de séquencer plusieurs isolats appartenant aux divers pathotypes. Ce séquençage a permis d’identifier plusieurs éléments, tels que du polymorphisme nucléotidique, des délétions ou encore des régions ayant un nombre de copies variable au sein des génomes, pouvant être associés significativement au pouvoir pathogène observée sur le cultivar tolérant. Enfin, à l’aide de techniques de qPCR, ces éléments ont servi au développement d’outils permettant la détection, à partir de cultures pures, d’isolats de X. hortorum pv. vitians susceptibles de causer la maladie sur le cultivar tolérant. Les travaux effectués dans le cadre de ce projet ont permis d’identifier plusieurs pathotypes de X. hortorum pv. vitians, ainsi que le développement d’outils moléculaires permettant la détection de X. hortorum pv. vitians susceptible de causer des symptômes sur le cultivar tolérant à la maladie de la tache bactérienne de la laitue. Mots clés : Xanthomonas hortorum pv. vitians, tache bactérienne, laitue, pouvoir pathogène, pathotype, séquençage de nouvelle génération, diagnostic. v REMERCIEMENTS En premier lieu, je tiens à remercier ma codirectrice de recherche Vicky Toussaint qui, au cours de mon baccalauréat, m’a intégré dans son équipe de recherche en tant que stagiaire, et m’a offert souplesse et liberté dans un projet de recherche qui nous tenait à cœur. Son encadrement m’a permis d’évoluer en tant que scientifique, mais aussi en tant que personne, en étant présente aux moments importants, en me supportant dans mes cheminements scolaire et professionnel et en posant les bonnes questions afin de faire progresser mon esprit critique. J’aimerais également remercier ma directrice de recherche Carole Beaulieu, qui a accepté, sans hésitation, de me diriger dans ce projet de maîtrise et qui a su amorcer les bonnes discussions afin de faire avancer les travaux. Merci à mon conseiller Kamal Bouarab, qui a apporté ses connaissances et son aide tout au long du projet. Merci aussi à Martin Laforest, mon autre conseiller, qui s’est avéré être un mentor hors pair dans des domaines hors de ma zone de confort qu’est la microbiologie. Les conseils et l’aide offerts par ma directrice de recherche et mes conseillers m’ont été très précieux à de nombreux moments au cours de mon cheminement aux études graduées. Je voudrais également remercier les membres de mon laboratoire, qui m’ont soutenu dans mes expériences tout au long de ma maîtrise et avec qui j’ai pu dissiper certains doutes dans les moments plus difficiles, sans oublier les responsables des serres au Centre de Recherche et de Développement de Saint-Jean-sur-Richelieu qui ont gentiment entretenu mes laitues pour le bien de mes essais. Aussi, je tiens à remercier la Fondation Laitue et le Gouvernement du Canada pour le financement de ce projet de recherche. Enfin, je désire remercier mes parents, mon frère ainsi que ma conjointe de m’avoir soutenu et encouragé dans les hauts et les bas de ce projet, de m’avoir incité à toujours donner le meilleur de moi-même, et d’avoir cru en moi. vi TABLE DES MATIÈRES SOMMAIRE ............................................................................................................................... iv REMERCIEMENTS .................................................................................................................. vi LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................................. xi LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... xiii LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. xiv CHAPITRE 1 INTRODUCTION GÉNÉRALE ......................................................................... 1 1.1 La culture de la laitue ......................................................................................................... 1 1.2 Les agents pathogènes et les maladies de la laitue ............................................................ 2 1.3 Xanthane et xanthomonadine ............................................................................................. 4 1.4 La tache bactérienne de la laitue ........................................................................................ 5 1.5 Diversité de Xanthomonas hortorum pv. vitians ............................................................... 8 1.6 Enjeu du projet de recherche ............................................................................................. 9 CHAPITRE 2 ÉTUDE GÉNOTYPIQUE ET PHÉNOTYPIQUE D’ISOLATS DE LA BACTÉRIE PATHOGÈNE DE LA LAITUE XANTHOMONAS HORTORUM PV. VITIANS PURIFIÉS AU QUÉBEC, CANADA ...................................................................... 11 2.1 Justification de l’article .................................................................................................... 11 Genotypic and phenotypic characterization