ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2020. Т. 75. № 2. C. 87–92 87 ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УДК 631.533:582.572.226 Размножение in vitro, рост и развитие ex situ редкого вида Lilium pensylvanicum Ker.-Gawl. (Liliaceae) Г.В. Филиппова*, В.Г. Дарханова, Н.С. Строева, О.А. Николаева, Д.Н. Андросова Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, Россия, 677980, г. Якутск, пр. Ленина, д. 41 *e-mail: [email protected] Показана возможность применения методов и подходов биотехнологии высших растений для сохранения и воспроизводства Lilium pensylvanicum. Использование семян в качестве первичных эксплантов позволило без причинения ущерба материнским растениям-доно- рам ввести вид в культуру in vitro. Субкультивирование асептических луковиц на среде Гамборга с половинным составом солей микро- и макроэлементов, обогащенной кинети- ном (5 мг/л) и индолилуксусной кислотой (1 мг/л), вызывало образование 3±1 луковиц на эксплант. Последующие пассажи на четырех вариантах сред позволили отметить среду Мурасиге-Скуга, дополненную 6-бензиламинопурином (0,4 мг/л), которая стимулирова- ла наилучшее развитие луковиц и рост побегов. Укоренение проводили на безгормональ- ных средах. Впервые проведены многолетние наблюдения за акклиматизацией растений- регенерантов ex situ. Пятилетние полевые наблюдения в условиях коллекционного питомника Якутского ботанического сада за выживаемостью, ростом и развитием расте- ний-регенерантов (n = 30) показали, что 77% особей успешно акклиматизировались. Массовое цветение и плодоношение было отмечено на четвертом году. Выявлены онтоге- нетические особенности развития молодых растений, которые выражались морфологиче- ской поливариантностью цветков и высокой изменчивостью высоты стебля. Разработан- ный протокол клонального микроразмножения Lilium pensylvanicum и результаты многолетних наблюдений за ростом растений-регенерантов позволяют рекомендовать этот метод для воспроизводства сокращающих численность ценопопуляций. Ключевые слова: Lilium pensylvanicum, культура in vitro, клональное микроразмножение, ex situ, рост, развитие В условиях техногенного и антропогенного Для введения различных видов растений воздействия на биосферу особую роль приобрета- в культуру in vitro в качестве эксплантов использу- ют подходы и методы, направленные на сбереже- ют надземные и подземные органы, фрагменты их ние и защиту биологического разнообразия. На- ткани и семена. Лилии можно размножать с ис- ряду с традиционными способами охраны пользованием нескольких видов тканей и органов, природных экосистем в условиях заповедников, включая листья, стебли, апикальные меристемы заказников, национальных парков, сохранения побегов, части цветка, семена и луковицы. При редких и исчезающих видов в семенных банках и в клональном микроразмножении лилий для созда- условиях интродукции (ex situ) все большее внима- ния регенерационных систем чаще всего исполь- ние заслуживает использование альтернативных зуют луковичные чешуи [8]. Лилии, особенно ред- биотехнологических методов. В настоящее время ких видов, как и другие цветочные культуры, эффективные методы культивирования in vitro часто подвержены болезням. Данный процесс мо- разработаны в отношении значительного числа жет сопровождаться значительным грибковым редких и исчезающих видов растений. Особый ин- и бактериальным инфицированием сегментов терес вызывает размножение редких и эндемич- изолированных луковиц, что определяет главный ных видов лилий, что обусловлено необходимо- недостаток этого типа экспланта. Для некоторых стью сохранения генетических ресурсов, пищевой видов лилии с достаточным семенным возобнов- и лекарственной ценностью, а также декоративно- лением имеются немногочисленные сведения стью этих растений [1–3]. Успешное использова- о работах с незрелыми и зрелыми семенами ние методов культуры ткани для размножения ви- [9, 10]. Вместе с тем такой подход позволяет не на- дов лилий, требующих специальных природо- носить ущерб уязвимым природным популяциям, охранных мер, описано для Lilium rhodopaeum [1], их естественному генетическому разнообразию L. speciosum [4], L. davidii [2], L. oxypetalum [5], и особенно важен в отношении популяций север- L. mackliniae [6], L. brownii [7] и др. ных территорий. ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2020. Т. 75. № 2 88 Г.В. Филиппова, В.Г. Дарханова, Н.С. Строева, О.А. Николаева, Д.Н. Андросова Lilium pensylvanicum Ker.-Gawl. – многолетнее нейных размеров и подсчета числа корней и по- травянистое растение с белой луковицей. Вид рас- бегов. пространен от Енисея до Камчатки, на Куриль- Акклиматизация к почвенным условиям ex situ. ских островах, Сахалине, севере Монголии, севе- Высадку растений-регенерантов (n = 30) в почву ро-востоке Китая, Кореи. В Якутии это южные, осуществляли в коллекционном питомнике БС юго-западные и центральные районы (до 64º с.ш.). ИБПК. Климатические условия участка типичны Неуклонное сокращение численности популяции для Центральной Якутии. Зима продолжительная, L. pensylvanicum в Якутии в результате чрезмерного морозная и малоснежная, а лето засушливое использования человеком и их исчезновение близ и жаркое. Годовые перепады температуры по абсо- населенных пунктов требуют необходимости при- лютному минимуму и максимуму достигают нятия специальных мер по охране вида. Категория 102ºС. В июле средняя температура составляет и статус редкости вида в Якутии – 2 б [11]. 18,7ºС, максимальная достигает 38ºС. В январе Настоящее исследование направлено на изу- средняя температура – минус 43,3ºС, минималь- чение особенности морфогенеза и регенерации в ная – минус 64ºС. Годовое количество осадков со- условиях in vitro, роста и развития ex situ редкого ставляет 247 мм. вида Lilium pensylvanicum. При посадке и уходе за растениями-регене- рантами использовали общепринятые агротехни- Материалы и методы ческие приемы (механическое разрыхление, вне- Семена L. pensylvanicum собраны с растений, сение перегноя и песка, полив, прополка). произрастающих в коллекционном питомнике Высадку растений осуществляли в лунки глуби- многолетней флоры Ботанического сада Институ- ной 5–10 см, расстояние между которыми состав- та биологических проблем криолитозоны (БС ляло 10–15 см. Для создания более благоприятно- ИБПК). го микроклимата в период приживаемости Введение в культуру in vitro. Поверхностную растений в течение двух недель использовали стерилизацию семян проводили промыванием, укрывной материал (лутрасил). Наблюдения за сначала в мыльном растворе (25–30 мин), затем по- ростом и развитием осуществляли 2–3 раза в не- следовательно в проточной и дистиллированной делю в течение всего вегетационного сезона. воде. Далее поэтапно семена трижды погружали Фенологические наблюдения ex situ проводи- в свежую порцию стерильной воды, 70%-ный эти- ли по методу, опубликованному ранее [14]. Учиты- ловый спирт (1 мин), трехкратно промывали сте- вали отрастание растений, переход в фазы рильной водой, замачивали в 10%-ном растворе листообразования и стеблевания, бутонизацию, хлорамина (30 мин) и вновь трижды промывали во- окрашивание бутонов, цветение, завязывание дой. Для удаления излишек воды семена помещали и созревание семян. При изучении биометриче- на фильтровальную бумагу. После стерилизации ских показателей учитывали линейные размеры в асептических условиях семена высаживали на стебля (высота), третьего листа (длина и ширина), безгормональные питательные среды Гамборга цветка (диаметр), лепестка (длина и ширина), с половинным составом минеральных солей (½ В5) число листьев и цветков. [12] и Мурасиге и Скуга (MS) [13]. Содержание са- Также оценивали всхожесть семян (%), коли- харозы составляло 40 г/л. Культивирование семян чество вновь образованных луковиц (шт./экс- и проростков проводили в свето-культуральной плант), выживание растений-регенерантов (%), комнате при 24±1ºС, 16-часовом фотопериоде, ос- количество растений в фазах цветения (%) и пло- вещенности 3000 лк и 70%-ной влажности. доношения (%). Микроклональное размножение. После форми- Статистическая обработка результатов. На рования проростков образовавшиеся листья и кор- этапе введения в культуру in vitro в культуральный ни удаляли, а очищенные луковицы помещали на сосуд высаживали по 20 семян в 4 повторностях. питательные среды. Для индукции образования ад- В экспериментах по индукции луковиц каждый вентивных луковиц использовали две питательные эксплант помещали в индивидуальную биологиче- среды, дополненные регуляторами роста: ½ В5 скую пробирку, для каждого варианта формирова- с 5 мг/л кинетина и 1 мг/л индолил-3-ук-сусной ли группы по 19 шт. Для наблюдений в культуре ex кислоты (ИУК) и МS с 1 мг/л кинетина и 0,1 мг/л situ формировали группу растений из 30 особей. ИУК. Дальнейшее микроразмножение осущест- Обработку данных проводили с учетом общепри- вляли разделением образовавшихся луковиц, кото- нятых методических указаний по биологической рые культивировали на питательных средах ½ В5 статистике. Результаты экспериментов представле- и МS с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) ны в виде средней арифметической (M) и ее стан- в двух концентрациях – 1 мг/л или 0,4 мг/л. Укоре- дартной ошибки (±SEM). Выборки сравнивали нение проводили на безгормональных питательных методом одно- и двухфакторного дисперсного ана- средах. Длительность пассажей составляла 60 сут. лиза (ANOVA), статистическую значимость разли- Морфологическую характеристику растений- чий определяли с использованием критерия Дан- регенерантов осуществляли путем измерения ли- нета для множественного сравнения при уровне ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2020. Т. 75. № 2 РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO, РОСТ И РАЗВИТИЕ EX SITU LILIUM