N E S S A Molekulargenetische Charakterisierung R F A von Schafrassen Europas H C S und des Nahen Ostens N auf der Basis von Mikrosatelliten O V G N U R E I Fotos: S. Jones (The Sheep Trust), I. Anton & C. Peter S I R E T K A R A Christina Peter H C E H C S I T E N E G R A L U K E L O INAUGURAL-DISSERTATION M zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. R E beim Fachbereich Veterinärmedizin T E der Justus-Liebig-Universität Gießen édition scientifique P VVB LAUFERSWEILER VERLAG A N I VVB LAUFERSWEILER VERLAG ISBN 3-8359-5006-1 T S GLEIBERGER WEG 4 I D-35435 WETTENBERG R H Tel: +49-(0)6406-4413 Fax: -72757 C [email protected] www.doktorverlag.de 9 7 8 3 8 3 5 9 5 0 0 6 1 édition scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme. 1. Auflage 2005 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers. 1st Edition 2005 © 2005 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Wettenberg Printed in Germany VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique GLEIBERGER WEG 4, D-35435 WETTENBERG Tel: 06406-4413 Fax: 06406-72757 Email: [email protected] www.doktorverlag.de Aus dem Institut für Tierzucht und Haustiergenetik der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. G. Erhardt MOLEKULARGENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON SCHAFRASSEN EUROPAS UND DES NAHEN OSTENS AUF DER BASIS VON MIKROSATELLITEN INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Christina Peter Tierärztin aus Werne Gießen 2005 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. M. Reinacher Gutachter: Prof. Dr. G. Erhardt Prof. Dr. G. Reiner Tag der Disputation: 01.12.2005 Die Untersuchungen wurden aus Mitteln der Europäischen Union finanziert (ECONOGENE QLK5-CT-2001-02461). Meiner Familie „Wissen, was man weiß, und wissen, was man nicht weiß, das ist wahres Wissen.“ Konfuzius INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG....................................................................................................1 2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................. 3 2.1 Domestikation der Hausschafe und deren Ausbreitung nach Europa ..................3 2.2 Bedrohungsstatus der Schafrassen Europas..............................................................6 2.3 Ursachen für das Aussterben von Rassen..................................................................7 2.4 Gründe für die Erhaltung von Rassen .......................................................................8 2.5 Mikrosatelliten als Markersystem zur Darstellung genetischer Diversität...........10 2.5.1 Mutationsraten und -mechanismen ....................................................................11 2.5.2 Mutationsmodelle..................................................................................................12 2.5.3 Anwendungsgebiete von Mikrosatelliten...........................................................12 2.5.4 Nachteile von Mikrosatelliten..............................................................................13 2.5.4.1 Nullallele...............................................................................................................14 2.6 Stand der Kartierung des Schafgenoms ...................................................................16 2.7 Untersuchungen zur genetischen Diversität beim Schaf......................................16 2.8 Einflussfaktoren auf die genetische Variation.........................................................23 2.9 Darstellung genetischer Differenzierung .................................................................24 2.9.1 Neis Gendifferenzierungskoeffizient GST..........................................................24 2.9.2 Wrights F-Statistik.................................................................................................24 2.9.3 Weir and Cockerhams F-Statistik........................................................................25 2.10 Statistische Verfahren zur Analyse von Populationsstrukturen............................26 2.10.1 Hauptkomponentenanalyse .................................................................................26 2.10.2 Bayesian Model-based Clustering Analyse.........................................................27 2.11 Genetische Distanzen als Maß genetischer Diversität ...........................................28 2.12 Identifizierung von unter Selektion stehenden Genorten .....................................29 2.13 Zuordnung von Einzeltieren zu ihrer Ursprungspopulation ................................30 3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................. 33 3.1 Probenmaterial.............................................................................................................33 3.1.1 Stichprobenmaterial..............................................................................................33 3.1.2 Standardproben .....................................................................................................34 3.1.2.1 DNA-Proben zur Standardisierung..................................................................34 3.1.2.2 Längen- und Konzentrationsstandards............................................................34 3.2 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................38 3.2.1 Chemikalien, Puffer und Reaktionskits..............................................................38 3.2.2 Enzyme...................................................................................................................38 I INHALTSVERZEICHNIS 3.2.3 Oligonukleotide.....................................................................................................38 3.2.4 Plastikwaren, Filter und Tücher ..........................................................................38 3.3 Geräte ...........................................................................................................................39 3.4 Computerprogramme .................................................................................................39 3.5 Molekularbiologische Methoden...............................................................................41 3.5.1 Gewinnung von Leukozyten aus Vollblut .........................................................41 3.5.2 Isolation von DNA aus Leukozyten...................................................................41 3.5.3 Bestimmung der DNA-Qualität bzw. -Quantität .............................................41 3.5.4 Polymerasekettenreaktion (PCR) ........................................................................41 3.5.4.1 Mikrosatellitenmarker.........................................................................................41 3.5.4.2 Einzel-PCR-Bedingungen ..................................................................................44 3.5.4.3 Multiplex-PCR zur Analyse am ABI PRISM® 377 DNA Sequencer...........45 3.5.5 Überprüfung der PCR-Bedingungen mit Hilfe eines Agarosegels.................47 3.5.6 Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese mit dem DNA Sequencer ...............................................................................................................48 3.5.6.1 Gellösung und -herstellung................................................................................48 3.5.6.2 Probenansatz und -vorbereitung.......................................................................49 3.5.6.3 Gelelektrophorese ...............................................................................................49 3.5.7 Standardisierung der Elektrophoreseergebnisse ...............................................49 3.6 Biometrische Methoden .............................................................................................50 3.6.1 Allelfrequenzen, FIS-Indizes, Hardy-Weinberg-Gleichgewicht und PIC-Werte ..............................................................................................................50 3.6.2 Kopplungsungleichgewicht..................................................................................50 3.6.3 Ausreißer-Analyse .................................................................................................50 3.6.4 Genetische Variabilität innerhalb der Populationen.........................................51 3.6.5 Überprüfung des Vorliegens eines Flaschenhalses...........................................51 3.6.6 Populationsstrukturen und genetische Variabilität zwischen den Populationen..........................................................................................................51 3.6.6.1 F-Statistik..............................................................................................................51 3.6.6.2 Genfluss................................................................................................................52 3.6.6.3 Genetische Distanzen.........................................................................................52