Efeitos da Exposição Pré-gestacional Materna a Moluscos Contaminados com Organoestânicos sobre a Morfofisiologia Reprodutivo-Placentária, os Substratos Energéticos e a Herança Multigeracional Fetal de Ratos Priscila Lang Podratz Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, outubro de 2018 Priscila Lang Podratz Efeitos da Exposição Pré-gestacional Materna a Moluscos Contaminados com Organoestânicos sobre a Morfofisiologia Reprodutivo-Placentária, os Substratos Energéticos e a Herança Multigeracional Fetal de Ratos Tese submetida ao Programa de Pós- graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Fisiológicas. Orientador: Prof. Dr. Jones Bernardes Graceli Coorientador: Prof. Dr. Elisardo Corral Vasquez Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, outubro de 2018 Este trabalho foi realizado majoritariamente no Laboratório de Endocrinologia e Toxicologia Celular, associado a Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, e no Laboratório multiusuário de Histotécnicas da Universidade Federal do Espírito Santo, com apoio das seguintes instituições: - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Espírito Santo (FAPES); - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). DEDICATÓRIA Esta tese é dedicada aos meus pais, Dirce e Ademar. “O saber a gente aprende com os mestres e com os livros. A sabedoria se aprende é com a vida e com os humildes.” (Cora Carolina) AGRADECIMENTOS Primeiramente, a Deus, pela dádiva da vida e por ter me iluminado nesta caminhada, fornecendo muita força e perseverança na luta por este objetivo, e sabedoria e crescimento diante das dificuldades. Aos meus pais, Dirce e Ademar, que sempre se preocuparam com a minha formação pessoal e acadêmica, me passaram os valores que me fizeram a pessoa que sou, abdicaram muitas vezes de suas vontades para me dar suporte e demonstraram amor incondicional; aos meus irmãos, Viviany e Flavio, pelo apoio, carinho e por serem presentes nos momentos de realizações e fraquezas (agradeço por poder contar sempre com todos vocês); ao Flavio e a minha cunhada Alessandra, por terem nos presenteado com o Miguel, afilhado e sobrinho que se tornou a alegria das nossas vidas e que por tantas vezes me ajudou a sorrir e a brincar, mesmo quando as preocupações e chateações aparentavam ser maiores. Ao meu namorado, Fabricio, companheiro nesses quase 4 anos, sempre disposto a me ouvir pacientemente e com uma piada na ponta da língua para me fazer rir e distrair. Agradeço por ter sido meu ombro amigo nos momentos de choro, desânimo e frustrações, e também durante as alegrias e reconhecimento. Por sempre buscar me ajudar e por entender os períodos de correria e de estresse. A tia Nair e tio Adolfo, pelo grande incentivo, alegria, carinho e cuidado que sempre tiveram por mim; meus primos Carol, Camila, Yasmin, Jean, Tiago e Lucas, que, apesar da distância física (para alguns), seguimos juntos com boas recordações, saudade, apoio e carinho; meus avôs (in memorian) Flora e Abraão, Ledia e Martinho, por serem grandes exemplos de luta pela vida. Aos grandes amigos do curso de Farmácia: Renatinha, Mari, Pati, Soni e Pedro. Embora tenhamos seguido, profissionalmente, por caminhos diferentes, a amizade continua firme e sou muito grata por isso. Obrigada pelo apoio, por poder desabafar, e por terem me estimulado e encorajado a persistir. As minhas amigas de infância, Lorena e Kárin, pelo apoio, incentivo e pelos encontros sempre tão cheios de felicidade, luz e gargalhadas. As amigas que conheci no laboratório: a May, por me transmitir uma confiança inabalável e por sempre me dizer aquilo que eu preciso ouvir; a Ju, pelas inúmeras ajudas nos experimentos e por todo conhecimento intra- e extra- laboratório compartilhado, crescemos muito nas nossas conversas, principalmente nos últimos 2 anos, e fui muito feliz por poder dividir contigo tantos sorrisos, choros, chocolates, cansaço, festas e viagens; a Gabi, pela companhia, alegria e viagens maravilhosas feitas juntas durante os vários anos de lab e, nestes 2 últimos, pelas conversas, desabafos e incentivo pela busca constante de coisas melhores. A todos os 35 colegas e amigos orientados pelo prof. Jones ao longo destes 8 anos e 4 meses que participei do laboratório, por transformarem muitas e cansativas horas de experimentos numa diversão, por termos criado uma convivência agradável e pelos ensinamentos. Em especial, aos atuais amigos e colegas de laboratório, Oscar, Tiago, Eduardo e Charles, e também aos alunos do prof. Ian, Higor, Neuza, Maria, Ludmila e Nicole, agradeço pela ajuda nos experimentos e empatia. A todos os colegas de pesquisa, que me ajudaram com tanta presteza e carinho; a todos os professores do PPGCF, dos departamentos de Morfologia e de Ciências Farmacêuticas, que abriram suas portas e colaboraram para que esta tese pudesse ser concluída; e aos laboratórios multiusuários da UFES, em especial, ao Histotécnico e as meninas, Luciene, Viviane e Rafaela, que sempre foram muito solícitas e me deram tanto apoio e ajuda nestes últimos 2 anos. A Drª. Mércia da Costa e sua aluna Millena Araujo, do Dept. de Ciências Biológicas, pela coleta e avaliações nos moluscos Leucozonia nassa; a profa. Maria Tereza Carneiro e a sua aluna Poliane Brandão, do Dept. de Química, pelas dosagens do estanho; ao prof. Ian, por ter me dado a primeira oportunidade de conhecer um laboratório de pesquisa; ao Diego e Afrânio, por terem me permitido acompanha-los nos experimentos no período de adaptação ao laboratório; ao prof. Vasquez, pela ajuda com a escrita do projeto de doutorado e pelo respeito e educação que tem ao compartilhar o seu enorme conhecimento pessoal e científico. Ao prof. Jones, por ter aberto portas para conhecermos outros centros científicos, pela oportunidade de realizar o doutorado e desenvolver esta pesquisa. Fico feliz de, após muita dedicação, ver o “trabalho de extrato” sendo reconhecido e concorrendo a prêmios em congressos internacional (ENDO 2017) e nacional (FESBE 2018). Ao apoio financeiro da UFES, CAPES, FAPES e CNPq. RESUMO Compostos organoestânicos (OTs), como o tributilestanho (TBT), são poluentes ambientais e a principal via de exposição humana ocorre por ingestão de mariscos contaminados. Estes agentes químicos atuam como desreguladores endócrinos em invertebrados marinhos e também em roedores, afetando, principalmente, a função reprodutiva e o metabolismo de lipídios e carboidratos. OTs podem acumular na placenta e são transferidos aos fetos. No entanto, ainda não há dados disponíveis sobre os efeitos da biotransferência dos OTs entre diferentes espécies de animais e os estudos sobre o perído gestacional e prole são escassos. O objetivo deste estudo foi avaliar a gênese e os mecanismos envolvidos nas alterações reprodutivas e do estado energético em ratas adultas, na disfunção placentária e nos prejuízos aos fetos de ambos os gêneros induzidos pela exposição direta e por herança multigeracional materna de ingestão de moluscos contaminados com OTs. Ratas Wistar de 3 meses de idade foram divididas em três grupos: tratadas diariamente com veículo (água destilada, controle, CON), com os gastrópodes Leucozonia nassa sem OTs (LNN, 600 mg/dia, coletados na Praia de Aracruz, Espirito Santo, área sem contaminação com OTs) ou Leucozonia nassa imposexados (LNI, 600 mg/dia, coletados na Praia da Ilha do Frade, Vitória, Espirito Santo, área contaminada com OTs), por 15 dias, via gavagem. Parte das ratas foram utilizadas para a avaliação da morfofisiologia reprodutiva e a outra parte foi alocada com machos controle para o acasalamento e posterior cesariana no 20º dia gestacional, para a análise de parâmetros gestacionais e a coleta da placenta e dos fetos. Ratas adultas LNI apresentaram aumento da concentração sérica de estanho, evidenciando a transferência dos OTs a partir da ingestão de moluscos contaminados. Essas fêmeas LNI desenvolveram irregularidade no ciclo estral; elevação nos níveis sérios de estrogênio, progesterona e testosterona; distúrbios na foliculogênese ovariana e deposição de colágeno perifolicular; hipertrofia e pontos de pseudoestratificação de epitélio luminal, processo inflamatório, aumento na deposição de colágeno e maior expressão de ERα uterino. Na fertilidade do grupo LNI, foi observado o atraso no estabelecimento da gestação, redução na frequência de ninhadas, diminuição do número de implantações e consequente aumento de perdas pré-implantação embrionária. Grávidas LNI exibiram aumento do perfil lipídico, com acúmulo hepático de vacúolos lipídicos redondos, de limites nítidos e tamanhos variáveis. Placentas LNI apresentaram aumento do peso e da porcentagem de células de glicogênio, associado a maior expressão de GLUT1 e de transferência de glicose pelo cordão umbilical; acúmulo de lipídios (triglicerídeos e colesterol total), com maior fornecimento de colesterol aos fetos; processo inflamatório; maior expressão das proteínas reguladoras IRβ, p-Akt e p-mTOR. Os fetos LNI, de ambos os gêneros, mostraram maior peso corporal; aumento de megacariócitos, lipídios e estresse oxidativo hepáticos. Estes achados conferem às ratas expostas diretamente aos OTs, por meio da ingestão de moluscos contaminados, características de síndrome do ovário policístico, e tal desregulação endócrina prejudica a formação