Tesis de doctorado Autora: Mag. Silvia Villar Orientador: Dr. Alvaro Novello Tribunal: Dr. Enrique Lessa, Dra. Graciela García, Dr. Guillermo Chalar “Me he dado cuenta que incluso aquellos que dicen creer en que todo está predestinado y que no podemos hacer nada para cambiarlo, miran antes de cruzar la carretera.” Stephen Hawking Agradecimientos: A mi familia, amigos y compañeros que me dieron su apoyo en el desarrollo de esta tesis. A mi tutor, por confiar en mí. INDICE Resumen 1 Introducción 3 Integridad Ecosistémica 3 Eutrofización 4 CONTAMINANTES: Biodisponibilidad, 5 bioacumulación y biomagnificación Fuentes de contaminación 6 Efluentes domésticos líquidos 8 Importancia de los humedales 10 CARACTERIZACIÓN AMBIENTAL: 12 biomonitores y bioindicadores El género Ctenomys como biomonitor 14 Caracterización ambiental: Aportes de la 15 GENÉTICA TOXICOLÓGICA Mutaciones 16 Mutación somática 16 Mutación germinal 17 Técnicas de estudio de genotoxicidad 18 Ensayo de electroforesis en células 18 individuales Test de micronúcleos 21 Allium test 23 Bibliografía 26 HIPOTESIS 33 OBJETIVOS 34 Sección IA. Caracterización del mayor humedal de 35 Playa Penino Estado actual 35 METODOLOGÍA 39 Área de estudio 39 Obtención de muestras 40 Citotoxicidad 40 Ensayo de electroforesis en células individuales 42 Test de Micronúcleos 43 Muestreo de agua, suelo y sedimento 44 Allium test 44 Determinación de parámetros físico-químicos 45 Análisis de aguas 46 Amonio 46 Nitrógeno total 46 Fósforo total 46 Nitrato 46 Fosfato 47 Análisis de suelos y sedimentos 47 Colecta de ejemplares vegetales 47 Análisis de presencia/ausencia de 48 agrotóxicos por cromatografía gaseosa Tratamiento de sedimentos para 49 espectrometría de masas Análisis microbiológico 51 Coliformes totales y fecales 51 Lámino-cultivos 53 Análisis estadísticos 53 Resultados 54 Ensayo de electroforesis en células individuales 54 Test de micronúcleos 55 Análisis de Allium test 56 Determinación de parámetros físico-químicos 58 Determinación de plaguicidas y 61 micronutrientes Parámetros microbiológicos 61 Análisis de correlación y MDS 63 Discusión 65 Biomarcadores de genotoxicidad 65 Parámetros ambientales 67 Ctenomys pearsoni como centinela 76 Bibliografía 77 Sección IB: Gradiente de impacto de efluentes 82 domésticos en Playa Penino Resultados 85 Ensayo de electroforesis en células individuales 85 Determinación de parámetros físico-químicos 87 Parámetros microbiológicos 89 Escalamiento multidimensional 90 Discusión 91 Biomarcadores de genotoxicidad 91 Parámetros físico-químicos y microbiológicos 92 Análisis de escalamiento multidimensional 94 Bibliografía 94 Sección IC. Saneamiento y biomarcadores de daño 96 genético en Ctenomys Resultados 97 Ensayo de electroforesis en células individuales 97 Test de micronúcleos 98 Biomarcadores de daño genético en Carrasco y 99 Penino Sección II. Ensayo de reparación de ADN e 103 inmunolocalización de p53 y BRCA1 en linfocitos de Ctenomys Reparación del material genético 103 Proteínas BRCA1 y p53 104 BRCA1 104 p53 108 Agentes genotóxicos: Bleomicina 110 Agentes genotóxicos: MMS 111 Cinética de reparación: Ensayo cometa 112 Objetivos de la Sección II 112 Metodología 113 Cultivo de linfocitos 113 Ensayo de cinética de reparación 113 Experimentos de inmunocitoquímica 114 Resultados 115 Ensayo de cinética de reparación 115 Análisis de la localización de p53 y BRCA1 119 Bleomicina 119 MMS 123 Discusión 127 Bibliografía 131 Glosario 134 135 ANEXO I. El test de micronúcleos en Ctenomys Bibliografía 141 DISCUSIÓN GENERAL 143 Conclusiones 145 Perspectivas 146 Bibliografía 148 Resumen La caracterización ambiental tradicionalmente se ha centrado en el análisis de la variabilidad en la abundancia y riqueza de especies, la modificación de las comunidades o las respuestas fisiológicas de grupos de organismos a parámetros físico-químicos (pH, materia orgánica, demanda biológica de oxígeno, demanda química de oxígeno, presencia y concentración de sustancias tóxicas). En otros países desde hace varios años, la comunidad científica ha utilizado biomarcadores de daño genético para determinar (a niveles subletales y previos al desarrollo de síntomas a nivel individual o de modificaciones en la estructura de poblaciones o comunidades), los efectos de una gran variedad de agentes xenobióticos sobre organismos nativos, de laboratorio o incluso sobre seres humanos. En Uruguay, sin embargo, los biomarcadores de genotoxicidad aún no se han incorporado como herramientas rutinarias para la caracterización ambiental o para el monitoreo biológico. La Genética Toxicológica aporta varios tipos de marcadores de daño genético de exposición aguda y crónica, así como de efecto, que se utilizan en análisis in vitro e in vivo sobre diversos organismos, que habitan ambientes de especial interés por su valor natural, pecuario o por las consecuencias sanitarias o ecológicas que los eventos de contaminación podrían generar. En esta tesis se realiza la caracterización ambiental del principal humedal de la Playa Penino (Departamento de San José) mediante el uso de biomarcadores de daño genético aplicados a organismos centinela (Ctenomys), mediante exposición in vitro de Liliáceas en ensayos validados, así como a través de parámetros físico- químicos vinculados a la carga de nutrientes y microorganismos patógenos. En el análisis de la relación entre los parámetros biológicos y ambientales, se concluye que la descarga de efluentes domésticos líquidos estaría vinculada a los altos índices de daño genético revelados por los biomarcadores utilizados. Los niveles de daño genético registrados, superan a los hallados en trabajos realizados en el sur de Brasil para el mismo centinela. Los niveles de genotoxicidad registrados en Playa Penino (área protegida sin saneamiento) superan a los registrados en individuos de la zona urbanizada de Carrasco (con saneamiento). Se estudia en profundidad uno de los marcadores de daño genético en Ctenomys; el test de micronúcleos, debido a la importancia que reviste el bazo en el alcance de esta herramienta, para detectar daño crónico o crónico reciente en eritrocitos de sangre periférica. Los resultados indican que dicho test revela daño crónico reciente (exposición de lapsos cortos). Por otro lado, se profundiza el análisis de la capacidad de reparación que estos organismos presentan frente a la acción de agentes mutagénicos conocidos (bleomicina y MMS) y el comportamiento de complejos proteicos fundamentales en la replicación, transcripción, ciclo celular y reparación del ADN (BRCA1 y p53). Ambas poblaciones utilizadas reparan el daño provocado por agentes mutagénicos en un lapso de 24 horas. Las proteínas p53 y BRCA1 se acumulan en el núcleo en forma temprana luego de producirse la exposición, visualizándose las señales en el citoplasma entre las 12 y las 24 horas, probablemente por la exportación del núcleo al citoplasma debido a modificaciones postraduccionales (proteínas ubiquitinadas o no fosforiladas que se degradan en el proteosoma). Las diferencias en los niveles de daño genético analizados a través de los marcadores de genotoxicidad, reflejan por ende, deterioro del ecosistema en Playa Penino y no se relacionan con diferencias en la maquinaria de reparación o control del ciclo celular. INTRODUCCIÓN INTEGRIDAD ECOSISTÉMICA Se ha definido integridad ecosistémica como la capacidad de un ecosistema para mantenerse balanceado, integrado y adaptado a sus condiciones externas (Karr, 1996), manteniendo su organización; su estructura y su función. La estructura se refiere a las interrelaciones entre los diferentes elementos del sistema, y la función a las actividades o procesos que ocurren dentro del sistema (Kay, 1991). Por ello, es necesario integrar estudios tendientes a analizar características funcionales de los ecosistemas (como descomposición de materia orgánica o aporte de nutrientes) y estructurales (disminución de ciertas especies o alteraciones de las mismas) (Gessner y Chauvet, 2002). Adicionalmente, la resiliencia del ecosistema es su habilidad de recuperarse frente a una perturbación (Jørgensen, 2005). Existen numerosos indicadores para analizar el estado de un ecosistema y la elección de los mismos dependerá de los objetivos que se persigan; la búsqueda de alteraciones tempranas, cumplimiento de límites establecidos por la ley, establecimiento de medidas de manejo y otros. Dichos indicadores deben cumplir con algunos requisitos indispensables: a) ser sensibles a cambios en etapas tempranas de modificación antrópica; b) ser económicos; c) ser sencillos de muestrear y medir; d) ser repetibles. La estructura de las comunidades (número de taxa, cantidad de individuos por taxón, presencia de grupos especialmente tolerantes a condiciones de perturbación o posteriores a ellas), la abundancia o índice de crecimiento de ciertas especies, presencia/ausencia de una o varias especies indicadoras, distribución de especies, familias, y grupos de organismos, relaciones entre los mismos, concentración de sustancias químicas, indicadores de flujos de energía y materia entre estructuras del sistema, alteraciones morfológicas, fisiológicas, celulares o genéticas de poblaciones que habitan los ecosistemas en estudio son ejemplos de indicadores (Schmitt y Osenberg, 1996; Pinilla, 1998; De Azevedo y Da Matta, 2004; Quiroga, 2007). Una de las principales formas de caracterizar un sistema acuático es a través de la determinación de su estado trófico. Si bien el proceso de colmatación de un ecosistema, producto del incremento gradual de la carga de nutrientes ocurre naturalmente