Université Paris Descartes École Doctorale 474 Frontières du Vivant Genetic control of bacterial morphogenesis par Antoine Vigouroux Thèse de doctorat de biophysique Dirigée par David Bikard et Sven van Teeffelen Présentée et soutenue publiquement le 27 mai 2019, devant un jury composé de : David Bikard Directeur Institut Pasteur Sven van Teeffelen Directeur Institut Pasteur Meriem El Karoui Rapporteuse University of Edinburgh Johannes Hohlbein Rapporteur Wageningen University Olivier Tenaillon Examinateur Université Paris Diderot Lydia Robert Examinatrice Université Pierre et Marie Curie Ivan Matic Examinateur Université Paris Descartes Résumé Depuis la découverte de l’ADN, notre compréhension de la morphogénèse bactérienne a beaucoup progressé mais aussi donné lieu à de nouvelles questions. La bactérie Escherichia coli est capable de maintenir une forme de bâtonnet de façon robuste, mais son génome ne contient aucun de plan de con- struction précis. La forme des cellules est déterminée dynamiquement par les enzymes qui synthétisent la paroi cellulaire, un polymère rigide qui entoure la cellule. Pour étudier quantitativement comment la biogénèse de la paroi et la forme des cellules dépend des concentrations des enzymes essentielles, nous utilisons un dérivé sans activité nucléase de CRISPR/Cas9 pour bloquer partiellement la transcription. Cette méthode n’ayant pas été utilisée avant, nous avons étudié ses propriétés en détail sur des rappor- teurs fluorescents. Cela nous a conduit à des découvertes surprenantes: on considérait auparavant que la répression dépendait de la fréquence de fixation de dCas9 à sa cible. Nous avons démontré un mécan- isme différent: la complémentarité guide/cible détermine la probabilité que la RNA polymérase déplace activement dCas9 lors de la transcription. Cela conduit à des propriétés désirables: la force de répression ne dépend pas du niveau d’expression natif de la cible, et n’ajoute pas de bruit extrinsèque à l’expression. Armés de cet outil, nous avons pour objectif de comprendre globalement comment les différents com- posants de la machinerie de synthèse de la paroi cellulaire sont articulés entre eux. Pour polymériser la paroi cellulaire, qui donne sa forme à la cellule, deux groupes d’enzymes ont été décrits: le complexe Rod et les PBP de classe A. Nous avons créé des souches exprimant ces deux catégories d’enzymes à des niveaux variables et caractérisé leurs phénotypes par différents moyens biophysiques (résistance mécanique, dif- fusion de molécules uniques, sensibilité à des antibiotiques...). Nous avons pu mettre en évidence que des enzymes avec des activités biochimiques similaires peuvent provoquer des réponses complètement différentes lorsque leurs niveaux sont changés. Ces travaux ont permis de mieux comprendre comment ces différents mécanismes sont coordonnés pour maintenir l’intégrité de la paroi à de multiples échelles. Abstract Since the discovery of DNA, our understanding of the morphogenesis of bacterial cells has made great advance and also gave rise to new questions. Even though the bacterium Escherichia coli is able to main- tain rod shape robustly, the genome does not encode any internal blueprint of what the cell should look like. Rather, cell shape is dynamically determined by the enzymes synthesizing the cell-wall, a rigid poly- mer that surrounds the cell. To quantitatively study the dependence of cell-wall biogenesis and cell shape on levels of essential cell-wall synthesis proteins, we use a nuclease-deficient CRISPR/Cas9 to partially block transcription. As this method had no been put into practice before, we thoroughly investigated its properties on a model system using fluorescent reporters. This led us to surprising findings: it was previ- ously assumed that decreased levels of guide RNA complementarity would decrease repression strength by virtue of reduced occupancy of the target. We demonstrated a different mechanism: complementarity determines the probability that RNA polymerase kicks out dCas9 during the transcription attempt, while the rate of spontaneous dCas9 unbinding is negligibly small. If dCas9 levels are high enough to saturate the target this mechanism alone determines repression strength. This leads to desirable properties: First, relative repression strength is independent of native expression levels. Second, repression does not add any extrinsic noise to gene expression. Armed with this tool, we aim get a global understanding of the in- terplay between the different components of the cell-wall machinery. To polymerize the cell wall , which gives its shape to the cell, two groups of enzymes were described: the Rod Complex and class A PBPs. We created strains expressing this two categories of enzyme at variable levels, then characterized their phenotypes by different biophysical means (mechanical resistance, single-molecule diffusion, antibiotic sensitivity...). This way, we could show that enzymes that share similar biochemical activities can elicit very different responses when their levels are changed. This work allowed to better understand how these different mechanisms are coordinated to maintain cell wall integrity at multiple scales. Genetic control of bacterial morphogenesis Remerciements First of all, I would like to thank my advisors David and Sven, for guiding me during these 3.5 years and always putting me back on track. Thanks to the members of my Thesis Advisory Committee, Ivo Boneca and Pascal Hersen, for their precious advice and support. I also thank the jury for taking the time to examine this work. A big thank to all the people who directly participated in the projects discussed in this thesis: Baptiste Cordier, Lun Cui, Alicia Calvo-Villamañan, Gizem Özbaykal, François Simon, Enno Oldewurtel, Richard Wheeler and Martin Sachse, and my two interns, Lucas and Dimitrije. For bearing with me during all these years, I address special thanks to the past and present members of my two labs. I met so many exceptional people here. Aude, Élise, Gizem, Alicia, Yuki, François, François, it was great to share the PhD experience with you. You’d better not forget me in your acknowledgements after I’m gone. Mes parents, même si l’on ne s’est pas vus si souvent, merci pour le réconfort, l’aide inestimable et les trucs bons. Diane, Augustin, on s’est tous retrouvés à travailler dur en même temps, vers la fin. Heureusement que vous étiez là. Lyam, Florian, Eugénie, Julien et Corentin, merci pour l’élévation philosophique et l’illumination spirituelle que leur sagesse et leur érudition m’ont apportées. Mes con- fères de pharma, Julien, Éric, William, Reynald, Quentin, vous m’avez tout appris. Merci à l’Ernestophone, ma fanfare, pour cette joie débordante et pour m’avoir fait me sentir à ma place. Mention particulière pour le personnel de la vigoumobile, le feat est lourd, vous êtes la peufra. Ma team iGEM, que des numéros dix. L’an 2015 est passé, mais l’équipe reste. Thanks CRI friends, Miza, Guillermo, Roberta, Anna, Olga, Aamir, Juli- ette and all others. To Pasteur people, Marisaõ, Corentin, Christiane, Dariusz, Lukas, Mélanie, Sarah, the RSG lab, and so many more. To my former neighbors from Cité U, you were the best neighbors I ever had and our crêpes were unrivaled. Merci aux acrimoines, qui ne trouveront jamais cette dédicace. Thanks to the developers of LATEX and R, my unsung heroes. Please don’t blame me too much if I forgot you, I did not sleep so much during the last few days. 1 Contents 1 How can bacteria be so large?8 1.1 Introduction.................................8 1.2 A matter of scales.............................. 10 1.3 Understanding bacterial morphogenesis................. 12 1.3.1 The shape of a bacterial cell.................... 12 1.3.2 The cell wall............................ 13 1.3.3 A bacterial cytoskeleton?..................... 14 1.3.4 Local coordination of cell wall synthesis............ 15 1.4 Investigating cell wall synthesis as a dynamical system......... 15 2 Progress and mysteries in CRISPR control of bacterial transcription 17 2.1 Introduction................................. 17 2.2 Turning the CRISPR adaptative immune system into artificial transcrip- tion factors................................. 18 2.3 Molecular and systemic mechanism.................... 20 2.3.1 A roadblock on the way of the RNA-polymerase........ 20 2.3.2 Consequences of the collision.................. 20 2.3.3 Mismatched guides and off-targets................ 22 2.3.4 Temporal dynamics and the search for target.......... 22 2.4 Improving CRISPR control of transcription............... 23 2.4.1 Tunable gene repression and activation............. 23 2.4.2 Simultaneous control of multiple targets............ 24 2.4.3 From one bacterium to all others................ 25 2.4.4 Addressing side effects...................... 25 2.5 Current applications............................ 27 2.5.1 Genome-wide CRISPR screens.................. 27 2.5.2 Synthetic biology and metabolic engineering.......... 28 2.6 Conclusion................................. 28 3 Tuning dCas9’s ability to block transcription enables robust, noiseless knockdown of bacterial genes 30 2 4 The ppppredictor 68 4.1 Introduction................................. 68 4.2 Cloning a large number of guide-target pairs.............. 69 4.3 Principle of the measurement....................... 70 4.3.1 By mRNA sequencing....................... 70 4.3.2 By fluorescence-activated cell sorting (FACS).......... 70 4.4 General structure of the library...................... 71 4.5 Designing the guide RNA pool......................