Universidade Nova de Lisboa Instituto de Higiene e Medicina Tropical Estudo dos flebótomos (Diptera, Phlebotominae), vectores de Leishmania sp. no Concelho de Torres Novas, Portugal Sofia Isabel Martins Branco Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Parasitologia Médica realizada sob a orientação científica de: Orientador – Professora Doutora Maria Odete Afonso Co-orientador – Professora Doutora Lenea Campino i Aos meus pais por terem esperado que encontrasse o meu rumo, ao Nuno por o ter consolidado, e ao Zoom, por ser o meu “Prozac” de quatro patas. ii AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer a todos os que me auxiliaram na realização deste trabalho, e cujo contributo foi essencial, dentro e fora do âmbito académico: À minha Orientadora, Professora Doutora Maria Odete Afonso, pela sua boa disposição e ―paixão flebotomínica‖, e pelo extraordinário empenho que dedicou à minha formação, ultrapassando em todos os aspectos o que se espera de um Orientador. Os seus ensinamentos, paciência e orientação contribuíram para o meu crescimento, não só a nível curricular, como pessoal e emocional. Um ―gigantesco‖ obrigada por tudo! À minha Co-Orientadora, Professora Doutora Lenea Campino, pelos ensinamentos na área das Leishmanias e Biologia Molecular e pelo entusiasmo e pragmatismo transmitidos. Ao Doutor Carlos Alves Pires, pelo seu bom humor, e disponibilidade em encontrar os ―artigos impossíveis‖, quando já não sabia mais onde os procurar. À Doutora Carla Maia, Doutora Sofia Cortes e Dr. José Manuel Cristovão da Unidade de Leishmanioses do IHMT, pelo auxílio na realização das técnicas laboratoriais moleculares. À Professora Doutora Luzia Gonçalves pelos esclarecimentos prestados na área da análise Estatística. Ao meu Avô António, ao meu Irmão Pedro e ao meu Tio Carlos, por toda a companhia e ajuda prestada nas capturas flebotomínicas, e aos meus Pais António e Tina pelo seu apoio incondicional. Ao Nuno Vieira pelo apoio gráfico e tratamento das imagens. Ao Coordenador da Unidade de Entomologia Médica do IHMT, Professor Doutor Paulo Almeida, e a todos os Colaboradores desta Unidade. Aos habitantes do Concelho de Torres Novas que permitiram a colocação das armadilhas CDC, nas suas propriedades, sem os quais não teria sido possível realizar este trabalho. iii RESUMO Estudo dos flebótomos (Diptera, Phlebotominae), vectores de Leishmania sp. no Concelho de Torres Novas, Portugal. Sofia Isabel Martins Branco PALAVRAS-CHAVE: flebótomos, bioecologia, Leishmania, Torres Novas, Portugal. Os flebótomos são insectos vectores de vários agentes patogénicos, dos quais se destacam os protozoários do Género Leishmania. Em Portugal, as leishmanioses, canina e humana, são causadas por L. infantum, sendo o cão o principal reservatório e Phlebotomus perniciosus e P. ariasi os vectores comprovados do parasita. São conhecidos três focos de doença, mas casos de leishmaniose canina têm sido reportados em outras regiões nas quais se desconhecem as espécies flebotomínicas presentes e respectivas taxas de infecção. Neste trabalho, efectuou-se a primeira prospecção flebotomínica no Concelho de Torres Novas, Distrito de Santarém, localizado na região Centro de Portugal. Os principais objectivos foram determinar a fauna flebotomínica do Concelho, os aspectos bioecológicos, as taxas de infecção por Leishmania e os factores de risco para a transmissão vectorial. De Junho a Novembro de 2010, 275 biótopos foram prospectados com armadilhas CDC. As capturas foram realizadas em 91 localidades, nas 17 freguesias do Concelho, e incluíram habitats domésticos, peridomésticos e silváticos. Os exemplares capturados foram identificados morfologicamente, as fêmeas utilizadas para detecção molecular de DNA de Leishmania e identificação das refeições sanguíneas. Análises de regressão simples e múltipla foram utilizadas para avaliação dos factores de risco para a presença das várias espécies flebotomínicas. Testes não paramétricos foram usados para comparar densidades. Dos 1262 flebótomos capturados, quatro espécies foram assinaladas com as seguintes abundâncias relativas: P. perniciosus 73,69%, P. ariasi 8,16%, P. sergenti 6,58% e Sergentomyia minuta 11,57%. Em 82% das localidades prospectadas foi detectada pelo menos uma espécie flebotomínica e em 71,4% destas foi capturada pelo menos uma das espécies comprovadamente vectoras de L. infantum. P. perniciosus foi assinalado em todas as 17 freguesias do Concelho. Os factores de risco identificados foram: temperaturas elevadas e humidades relativas baixas, locais abrigados e ausência de vento forte, presença de pinheiros como vegetação dominante, biótopos peridomésticos, particularmente currais de ovelhas e coelheiras, ou na proximidade de ovelhas, aves de capoeira e ninhos com andorinhas. A taxa de infecção flebotomínica por L. infantum foi de 4% para P. ariasi e de 0,32% para o total de fêmeas capturadas. A maioria das fêmeas para as quais se identificou a origem da refeição sanguínea pertencia a P. perniciosus. Esta espécie apresentou um comportamento oportunista, alimentando-se numa grande variedade de hospedeiros vertebrados. iv A elevada abundância e distribuição das espécies vectoras, juntamente com a seroprevalência de Leishmania nos cães do Distrito (5-10%), e a captura de uma fêmea grávida de P. ariasi (infectante), sugerem que o Concelho de Torres Novas é um foco de leishmaniose no país. A maior abundância relativa de P. sergenti, comparando com prospecções realizadas noutras áreas da região Centro de Portugal, sugere que este potencial vector esteja a expandir-se para latitudes mais elevadas, aumentando o risco de introdução de L. tropica no território, por contacto com imigrantes ou viajantes infectados de áreas endémicas. A monitorização flebotomínica, e dos hospedeiros vertebrados, deverá ser continuada no Concelho para que medidas eficazes de controlo possam ser definidas e implementadas. v ABSTRACT Study of phlebotomine sand flies (Diptera, Phlebotominae), vectors of Leishmania sp. in Torres Novas Municipality, Portugal. Sofia Isabel Martins Branco KEYWORDS: phlebotomine sand flies, bioecology, Leishmania, Torres Novas, Portugal. Phlebotomine sand flies are hematophagous dipterans responsible for vectorial transmission of several pathogens, including protozoans of Genus Leishmania. In Portugal human and canine are caused by L. infantum, the dog the main reservoir, and Phlebotomus perniciosus and P. ariasi are the proven vectors of the parasite. Three foci are known but canine leishmaniasis has been reported from several other areas in the country, for which sand fly species and their infection rates are unknown. This study is the first phlebotomine survey in Torres Novas Municipality, Santarém District, in Central Region, Portugal. The main objectives were to identify the phlebotomine species, their bioecological aspects, Leishmania infection rates, and vectorial transmission risk factors in the municipality. From June to November, 2010, 275 biotopes were surveyed with CDC light traps. Captures were performed in 91 localities, covering the 17 parishes of the Municipality, and included domestic, peridomestic and silvatic biotopes. Captured specimens were identified morphologically and females were used for molecular detection of Leishmania DNA and blood meal identification. Simple and multiple regression analysis were used to determine risk factores for phlebotomine presence. Nonparametric tests were used to compare densities. A total of 1262 sand flies were captured and identified. Four of the five species known for Portugal were detected, with the following relative abundances: P. perniciosus 73.69%, P. ariasi 8.16%, P. sergenti 6.58% and Sergentomyia minuta 11.57%. In 82% of localities at least on phlebotomine species was observed and in 71.4% at least one L. infantum comproved vector species was present. P. perniciosus was captured in all the Municipality 17 parishes. Risk factores were identified as: high average temperatures and low relative humidities, sheltered locations and absence of strong wind, presence of pine trees as dominant vegetation, peridomestic biotopes, particularly sheep pens and rabbit warrens, or in proximity of sheep, poultry and swallow nests. L. infantum infection rate was 4% for P. ariasi and 0.32% for the total of phlebotomine females. P. perniciosus exhibited an opportunistic behavior, feeding in a wide variety of vertebrate hosts. The high abundance and distribution of comproved vector species, combined with the dogs Leishmania seroprevalence in the District (5-10%), and the capture of a vi gravid infecttive female, suggest that Torres Novas Municipality is a leishmaniasis focus in the country. The higher abundance of P. sergenti, compared with surveys done in other areas of Central region of Portugal, suggests the vector may be expanding to higher latitudes, increasing the risk of introduction of L. tropica in the territory, by contact with infected immigrants or travelers from endemic areas. Phlebotomine and vertebrate hosts monitoring should be implemented in the region and effective control measures developed. vii ÍNDICE Agradecimentos ........................................................................................................................... iii Resumo ........................................................................................................................................ iv Abstract .......................................................................................................................................