Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis DISSERTATION zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Katharina Schäfer Bayreuth, 2011 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 2007 bis November 2011 am Lehrstuhl für Genetik der Universität Bayreuth unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Thomas Wiegert (Hochschule Zittau/Görlitz) angefertigt. Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). Dissertation eingereicht am: 04.11.2011 Zulassung durch die Promotionskommission: 16.11.2011 Wissenschaftliches Kolloquium am: 30.03.2012 Amtierende Dekanin: Prof. Dr. Beate Lohnert Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Thomas Wiegert (Erstgutachter) Prof. Dr. Birgitta Wöhrl (Zweitgutachterin) Prof. Dr. Ortwin Meyer (Vorsitzender) Prof. Dr. Franz X. Schmid PD Dr. Steffen Kolb „Das Leben wird vorwärts gelebt und rückwärts verstanden!“ Søren Kierkegaard (1813 – 1855) Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................................... I Zusammenfassung .................................................................................................................... 1 Summary ................................................................................................................................... 3 1 Einleitung .......................................................................................................................... 5 1.1 Bakterien im Allgemeinen und B. subtilis im Speziellen ........................................... 5 1.2 Regulation der Genexpression in Bakterien ............................................................... 6 1.3 Regulation der Transkription ..................................................................................... 6 1.4 Initiation der Transkription durch Sigmafaktoren ...................................................... 7 1.5 Primäre und sekundäre Sigmafaktoren ...................................................................... 7 1.6 ECF-Sigmafaktoren .................................................................................................... 8 1.6.1 Regulation von ECF-Sigmafaktoren ...................................................................... 9 1.6.1.1 Regulation des ECF-Sigmafaktors E aus E. coli ....................................... 11 1.6.1.2 Regulation des ECF-Sigmafaktors W aus B. subtilis ................................ 12 1.6.2 Der ECF-Sigmafaktor X aus B. subtilis .............................................................. 13 1.6.2.1 Das X-Regulon .......................................................................................... 14 1.6.2.2 Physiologische Rolle von X ...................................................................... 16 1.6.2.3 X-Regulation durch einen Anti-Sigmafaktor ............................................ 17 1.7 Termination der Transkription ................................................................................. 19 1.7.1 Faktorunabhängige Termination .......................................................................... 19 1.7.2 Faktorabhängige Termination .............................................................................. 20 1.7.2.1 Der Faktor Rho ........................................................................................... 21 1.7.2.2 Mechanismus der faktorabhängigen Termination....................................... 22 1.7.2.3 Die Nus-Faktoren ........................................................................................ 24 1.8 Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................... 25 I Inhaltsverzeichnis 2 Material und Methoden ................................................................................................. 26 2.1 Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide ................................................... 26 2.2 Verwendete Puffer und Lösungen ............................................................................ 33 2.3 Antibiotika-Lösungen ............................................................................................... 43 2.4 Antikörper ................................................................................................................ 43 2.5 Längenstandards ....................................................................................................... 44 2.6 Mikrobiologische Methoden .................................................................................... 45 2.6.1 Nährmedien .......................................................................................................... 45 2.6.2 Kulturverfahren .................................................................................................... 46 2.6.2.1 Aufnehmen von Wachstumskurven ............................................................ 46 2.6.2.2 Anlegen von Glycerin-Dauerkulturen ......................................................... 47 2.6.3 Fluoreszenzmikroskopie ....................................................................................... 47 2.6.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und -quantifizierung von GFP-Fusionen ............ 47 2.6.3.2 Fluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung der Zellmorphologie ................ 48 2.6.4 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation .......................................... 48 2.6.4.1 Genetische Manipulation von E. coli-Zellen .............................................. 48 2.6.4.1.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen ................................. 48 2.6.4.1.2 Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente E. coli-Zellen .......................................................................................... 49 2.6.4.1.3 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen für die Elektroporation ....................................................................................... 49 2.6.4.1.4 Elektroporation von E. coli-Zellen ......................................................... 50 2.6.4.2 Genetische Manipulation von B. subtilis-Zellen ......................................... 50 2.6.4.2.1 Herstellung kompetenter B. subtilis-Zellen ............................................ 50 2.6.4.2.2 Transformation von Plasmid- oder chromosomaler DNA in kompetente B. subtilis-Zellen ..................................................................................... 51 2.6.4.2.3 SPP1-Phagen Transduktion in B. subtilis ............................................... 52 2.6.4.2.4 Transposonmutagenese ........................................................................... 52 II Inhaltsverzeichnis 2.7 Molekularbiologische und genetische Methoden ..................................................... 52 2.7.1 Isolierung von Nukleinsäuren .............................................................................. 52 2.7.1.1 Isolierung von Gesamt-DNA aus B. subtilis ............................................... 52 2.7.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli .................................................... 53 2.7.1.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA durch Mini-Präparation (Boiling Präparation) ............................................................................................ 53 2.7.1.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA durch Midi-Präparation .......................... 54 2.7.1.3 Isolierung von Gesamt-RNA aus B. subtilis ............................................... 54 2.7.2 Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration ...................... 55 2.7.3 Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) ......... 56 2.7.3.1 Standard-PCR ............................................................................................. 56 2.7.3.2 Kolonie-PCR ............................................................................................... 57 2.7.4 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren .................................................. 58 2.7.4.1 Enzymatische Hydrolyse von Nukleinsäuren ............................................. 58 2.7.4.2 Ligation von Nukleinsäuren ........................................................................ 59 2.7.5 Reinigung von DNA-Fragmenten nach der PCR bzw. nach anderen enzymatischen Reaktionen ................................................................................... 60 2.7.6 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................. 61 2.7.6.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese ............................................................... 61 2.7.6.2 RNA-Agarose-Gelelektrophorese ............................................................... 61 2.7.7 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen (Gelextraktion) ....................... 62 2.7.8 Sequenzierung ...................................................................................................... 62 2.7.9 Herstellung einer DIG-markierten DNA-Sonde................................................... 62 2.7.10 Reinigung von DNA-/RNA-Sonden durch Präadsorption ................................. 62 2.7.11 Southern Blot ...................................................................................................... 63 2.7.12 Hybridisierung