รายงานวิจัยฉบับสมบูรณ์ โครงการ: การพิสูจน์หาหน้าที่ของ Putative Exo-1,3- Glucanase Gene ของเชื้อ Pythium insidiosum (Functional Characterization of the Putative Exo-1,3- Glucanase Gene of the Human Pathogenic Oomycete Pythium insidiosum) โดย น.พ. ธีรพงษ์ กระแจะจันทร์ ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะแพทยศาสตร์ โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล เดือน ปี ที่เสร็จโครงการ: มิถุนายน 2556 สัญญาเลขที่ RMU5380047 รายงานวิจัยฉบับสมบูรณ์ โครงการ การพิสูจน์หาหน้าที่ของ Putative Exo-1,3- Glucanase Gene ของเชื้อ Pythium insidiosum (Functional Characterization of the Putative Exo-1,3- Glucanase Gene of the Human Pathogenic Oomycete Pythium insidiosum) โดย น.พ. ธีรพงษ์ กระแจะจันทร์ ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะแพทยศาสตร์ โรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล สนับสนุนโดยสานักงานคณะกรรมการการอุดมศึกษา และสานักงานกองทุนสนับสนุนการว ิจัย (ความเห็นในรายงานนี้เป็นของผู้วิจัย สกอ. และ สกว. ไม่จาเป็นต้องเห็นด้วยเสมอไป) 1 สารบัญ หัวข้อ หน้า Abstract อังกฤษ 3 ไทย 4 เนื้อหาวิจัย ข้อมูลโครงการ (รหัส, ผู้วิจัย, ระยะเวลา, Keywords) 5 บทน า 5 วัตถุประสงค์ 11 วิธีการทดลอง 11 ผลการทดลอง 26 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง 43 เอกสารอ้างอิง 51 Output จากโครงการวิจัย ผลงานวิจัยที่เสร็จแล้ว 56 การน าผลงานวิจัยไปใช้ประโยชน์ 56 อื่นๆ (การประชุม, book chapter, patent) 57 ภาคผนวก Reprint และ บทความเผยแพร่ 58 2 ABSTRACT Pythium insidiosum is the etiologic agent of pythiosis, an emerging and fatal infectious disease of humans and animals living in tropic and subtropic countries. P. insidiosum exists in two stages: branching hyphae and biflagellate zoospore. Although morphology of P. insidiosum resembles to fungi, but it is closely related to diatom and algae. Human pythiosis is found mostly in Thailand, while the disease state in animals is found worldwide. Thalassemia is a predisposing factor. Healthcare professionals are unfamiliar with the disease. Diagnosis of pythiosis is difficult. Conventional antifungal drugs are ineffective, leaving radical surgery of infected organ is the main treatment option for pythiosis. It is apparent that more needs to be done in the way of basic research to provide insights into P. insidiosum’s biology and pathogenesis, and thereby lead to the discovery of novel strategies for pathogen and infection control. Recently, we have identified a 74-kDa immunoreactive protein of P. insidiosum. Proteomic and genetic analyses revealed a partial P. insidiosum exo-1,3-ß-glucanase gene (PinsEXO1) sequence that encodes this immunogen. In pathogenic fungi, glucanases have roles in morphogenesis, pathogenesis, and host immune responses. Role of the gucanase in P. insidiosum is unknown. PinsEXO1 might have functions resembled to fungal glucanases, and could be a potential virulence factor, diagnostic target, and vaccine candidate. In this project, we aims to characterize PinsEXO1 and apply the gene for clinical uses. Full-length PinsEXO1 (2,229 bp) was successfully identified, using Adaptor and RACE PCR. Sequence analysis showed that PinsEXO1 was phylogenetically different from fungal glucanases. PinsEXO1 was significantly up-regulated when it grew at body temperature, compared to room temperature. Limited carbon source down-regulated PinsEXO1. We showed that PinsEXO1 was an efficient DNA target for specific PCR identification of P. insidiosum. Two B-cell epitopes of PinsEXO1 protein (Peptide-A and B), predicted by bioinformatics analysis, were strongly reactive against sera from pythiosis patients, but not control sera tested. Western blot analysis of hyphal and culture filtrate antigens, using rabbit anti- Peptide-A/B serum, showed that PinsEXO1 was not secreted. Immunostaining suggested that PinsEXO1 localized at cell wall. By comparing the two peptides, Peptide-A was a more suitable epitope for development of an efficient peptide-based ELISA for diagnosis of pythiosis. In conclusion, the glucanase gene, PinsEXO1, of P. insidiosum, was first immunologically and genetically characterized here. Highly-expressed PinsEXO1 at body temperature and surface localization of its protein imply that the gene might have role in host interaction. PinsEXO1 was proven to be useful for molecular and immunological detection of P. insidiosum. 3 บทคัดย่อ Pythium insidiosum คือ fungus-like microorganism ที่อยู่ในกลุ่ม oomycetes และเป็นสาเหตุของโรคติด เชื้อร้ายแรงที่เรียกว่า “Pythiosis”. โรคนี้เกิดได้ในคนและสัตว์ที่อาศัยอยู่ในประเทศเขตร้อน. ประเทศไทย ถือเป็น endemic area ของโรค pythiosis ที่เกิดในคน. ในปจจุบันั มีการรายงานการพบโรค pythiosis มากขึ้น. อย่างไรก็ตาม ความรู้ความเข้าใจเกี่ยวกับโรคนี้ยังมีไม่มากนัก. ผู้ปวยเกือบทั้งหมดจะมีการ่ พยากรณ์โรคไม่ดี. การวินิจฉัยมีความยากลาบาก. การรักษาด้วยราต้านเชื้อราไม่ได้ผล การรักษาหลักจึง เป็นการผ่าตัดส่วนที่ติดเชื้อออก (อวัยวะที่ติดเชื้อมากที่สุดคือตาและขา) ซึ่งทาให้เกิดความพิ การถาวร และในบางรายการที่โรคลุกลามไปมาก ผู้ปวยจะเสียชีวิตจากการติดเชื้อในที่สุด.่ เมื่อพิจารณาถึงปญหาั การวินิจฉัย พบว่ามีความต้องการชุดทดสอบที่มีประสิทธิภาพ ให้ผลรวดเร็ว และสามารถใช้ได้ง่าย. และ หากพิจารณาถึงปญหาการรักษาั พบว่ามีความจาเป็นที่ต้องศึกษาด้านวิ ทยาศาสตร์พื้นฐาน เพื่อค้นหา วิธีการรักษาใหม่ที่ได้ผลดีกว่าเดิม เช่น ยาหรือวัคซีนต้านเชื้อ Pythium. เมื่อไม่นานมานี้ คณะผู้วิจัยได้ รายงานการพบ immunodominant protein ขนาด 74-kDalton ของเชื้อ P. insidiosum และจากการ วิเคราะห์ทางด้าน Proteomic and genetic พบยีนที่ถอดรหัสเป็นโปรตีนนี้คือ exo-1,3-β-glucanase gene (PinsEXO1). Glucanase เป็นโปรตีนที่น่าสนใจ เพราะในเชื้อราบางชนิด glucanase มีบทบาทใน การเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเชื้อ, ช่วยก่อให้เกิดโรค (การเกาะติดและการชอนไชเนื้อเยื้อโฮส), และมี บทบาทในการกระตุ้นภูมิกันของร่างกาย. หน้าที่ของ P. insidiosum glucanas อาจจะเหมือนกับที่พบใน เชื้อรา แต่ก็ยังไม่มีการพิสูจน์. วัตถุประสงค์ของโครงการนี้คือ เพื่อศึกษาหน้าที่ของ P. insidiosum PinsEXO1 และใช้ประโยชน์จากยีนนี้ในทางคลินิก. จากการใช้เทคนิค Adaptor and RACE PCR ทาให้ สามารถทราบลาดับเบสของ PinsEXO1 ทั้งหมด. เมื่อศึกษาความสัมพันธ์ทาง phylogenetics พบว่า PinsEXO1 มีลาดับเบสแตกต่างกับเชื้อราชนิดอื่นๆ. เมื่อดูการแสดงออกของยีน พบว่า PinsEXO1 แสดงออกสูงเมื่อเชื้อเจริญที่อุณหภูมิร่างกาย และมีการแสดงออกต่าเมื่อเชื้อเจริญในภาวะที่ขาดคา ร์บอน. คณะผู้วิจัยได้ใช้ PinsEXO1 เป็นเป้าหมายในการตรวจหา P. insidiosum ด้วยวิธี PCR พบว่ามี ประสิทธิภาพดี. นอกจากนี้ยังใช้วิธีทาง Bioinformatics คานาย B-cell epitopes ได้ 2 epitopes คือ Peptide-A และ -B ซึ่งมี binding activity ดีกับ anti-P. insidiosum antibody ใน serum ผู้ปวย่ pythiosis ทั้งหมดที่ทดสอบ. จากการทา Western blot analysis กับ crude antigens ที่สกัดได้จากเชื้อ ร่วมกับ antibody จากกระต่ายที่สร้างต่อ Peptide-A และ –B พบว่าโปรตีน PinsEXO1 ไม่มีการหลั่งออกมานอก เซลล์ และการใช้ immunostaining assay บ่งบอกว่าโปรตีน PinsEXO1 อยู่ที่ผนังเซลล์. เมื่อเปรียบเทียบ Peptide-A และ –B เพื่อใช้ทา Peptide ELISA สาหรับวินิจฉัยโรค Pythiosis พบว่า Peptide-A มี ประสิทธิภาพดีกว่า. โดยสรุป โครงการวิจัยนี้ได้ทาการศึกษายีน PinsEXO1 ของ P. insidiosum ในด้านที่ เกี่ยวกับภูมิคุ้มกันวิทยาและยีเนติกส์เป็นครั้งแรก และแสดงว่ายีน PinsEXO1 อาจมีบทบาทต่อการเกิด โรค. นอกจากนี้ยีน PinsEXO1 ยังสามารถน ามาประยุกต์ใช้เพื่อการวินิจฉัยการติดเชื้อ P. insidiosum ได้ อย่างดี. 4 เนื้อหางานวิจัย 1. รหัสโครงการ RMU5380047 2. ชื่อโครงการ การพิสูจน์หาหน้าที่ของ Putative Exo-1,3- Glucanase Gene ของเชื้อ Pythium insidiosum (Functional Characterization of the Putative Exo-1,3- Glucanase Gene of the Human Pathogenic Oomycete Pythium insidiosum) 3. ชื่อหัวหน้าโครงการ น.พ. ธีรพงษ์ กระแจะจันทร์ (Theerapong Krajaejun) ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะแพทยศาสตร์ โรงพยาบาลรามาธิบดี หมายเลขโทรศัพท์ (02) 201-1379 E-mail address: [email protected] สาขาวิชาที่ทาวิจัย : สาขาวิทยาศาสตร์การแพทย์และเทคโนโลยีชีวภาพ งบประมาณทั้งโครงการ: 1,200,000 บาท 4. ระยะเวลาโครงการ: 3 ปี (15 มิถุนายน 2553 – 14 มิถุนายน 2556) 5. Keywords: Pythium insidiosum; Pythiosis; Glucanase; Characterization; Diagnostic assay 6. บทน า 6.1 Background and significance of human pythiosis โรค human pythiosis เป็นโรคติดเชื้ออุบัติใหม่ (emerging infectious disease) [1–4]. รายงาน ผู้ปวยเกือบทั้งหมดมาจากประเทศไทย่ [4]. นอกจากพบในคนแล้ว ยังพบโรคนี้ในสัตว์ด้วย เช่น สุนัข แมว ม้า และวัว ที่อาศัยอยู่ในประเทศเขตร้อน [1–3]. โรค pythiosis มีความรุนแรงถึงขั้นพิการหรือเสียชีวิต เกิดจากการติดเชื้อ Pythium insidiosum ซึ่งเป็ นเชื้อในกลุ่ม oomycetes ที่จัดอยู่ใน Phylum Pseudofungi, Kingdom Chromista (Stramenopila) [3]. เชื้อ ใน ก ลุ่ ม oomycetes มีลัก ษ ณ ะท าง physiology และ genetics เฉพาะตัว จึงถูกจัดแยกจาก microorganisms อื่นๆ เช่น fungi, viruses, bacteria หรือ parasites [5]. ในธรรมชาติ เชื้อ P. insidiosum อาศัยอยู่ในน้าหรือที่ชื้นแฉะ ในรูปของสาย รา (Figure INTRO-1) [6]. เมื่อมีสิ่งแวดล้อมที่เหมาะสม เชื้อ P. insidiosum สามารถสร้าง zoospore (Figure INTRO-1) ซึ่งมี flagella ช่วยในการว่ายน้า. Zoospore เป็นส่วนส าคัญของกระบวนการติดเชื้อ เพราะ zoospore สามารถว่ายน้า ไปเกาะผิวหนังหรือเยื่อบุต่างๆ ของคนหรือสัตว์ และงอกเป็นสายรา เพื่อ ชอนไชไปสู่เนื้อเยื่อที่อยู่ลึกลงไป และก่อให้เกิดพยาธิสภาพ [6]. 5 Figure INTRO-1. รูปถ่ายจากกล้อง light microscope แสดงลักษณะของเชื้อ Pythium insidiosum: (A) สายรา (hphae) และ (B) zoospores sac ภายในมี zoospores อยู่ [7]. รายงานการพบโรค human pythiosis ครั้งแรกมาจากประเทศไทยในปี พ.ศ. 2528 [2,4,8]. จากนั้น โรคนี้ก็เริ่มเป็นที่รู้จักและมีการรายงานผู้ป่วยเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ส่วนใหญ่เป็นผู้ปวยจากประเทศไทย่ [2,4,7– 16]. จึงถือได้ว่าประเทศไทยเป็น endemic area ของโรค pythiosis ในคน. เนื่องจาก human pythiosis เป็นโรคที่รู้จักได้ไม่นาน ข้อมูลเกี่ยวกับโรคนี้ยังน้อยมาก และบุคลากรทางการแพทย์ส่วนใหญ่อาจจะยังไม่ คุ้นเคยกับโรค ดังนั้นข้าพเจ้าและคณะฯ จึงได้รวบรวมข้อมูลผู้ปวยโรค่ pythiosis ที่วินิจฉัยระหว่างปี พ.ศ. 2528 ถึง 2546 จาก 9 โรงพยาบาลทั่วประเทศ มาวิเคราะห์ทางคลินิกและทางระบาดวิทยา [4] เพื่อให้ เข้าใจโรคในทางคลินิกมากขึ้น และเพื่อเป็นข้อมูลพื้นฐานส าหรับการวิจัยแง่มุมอื่น. ในการศึกษานี้ พบ ผู้ปวยจ่ านวน 102 ราย