UNIVERSIDAD DE SALAMANCA FACULTAD DE BIOLOGÍA Departamento de Microbiología y Genética CARACTERIZACIÓN DE UN VIRUS QUE INFECTA AL HONGO ENDOFÍTICO Epichloë festucae María Romo Vaquero 2010 UNIVERSIDAD DE SALAMANCA FACULTAD DE BIOLOGÍA Departamento de Microbiología y Genética CARACTERIZACIÓN DE UN VIRUS QUE INFECTA AL HONGO ENDOFÍTICO Epichloë festucae Memoria que presenta la Licenciada en Biología María Romo Vaquero para optar al grado de Doctor por la Universidad de Salamanca Salamanca, Octubre de 2010 “Primero te ienoran, después se ríen de ti, luego te atacan, entonces eanas” Mahatma Gandhi. Agradecimientos Esta tesis doctoral, si bien ha requerido de esfuerzo y mucha dedicación por parte de la autora durante seis años, no hubiese sido posible su finalización sin la cooperación desinteresada de todas y cada una de las personas que a continuación citaré. Quiero expresar mi agradecimiento al Dr. Iñigo Zabalgogeazcoa González, director de esta Tesis Doctoral, por darme la oportunidad de llevarla a cabo , así como por sus sugerencias sin las cuales no hubiera sido posible la elaboración de este trabajo. Igualmente quisiera agradecer a todo el Departamento de Pastos del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca su cooperación en la realización de esta tesis doctoral. Agradecer también al Dr Balbino García Criado y la Dr. Mª Antonia García Ciudad su apoyo en el logro de la beca de tres años, con la cual se financió ésta tesis. De igual forma, quiero mencionar la valiosísima ayuda desinteresada de la Dr. Rosa Esteban, cuya orientación fue clave para la consecución de resultados favorables. Especialmente, también quisiera dar mi más sincero agradecimiento a D. José Matías Hernández Sánchez, por su colaboración y aliento así como por su implicación personal en todo momento. Agradecer a la Dra. María Teresa García Conesa, que me brindara la oportunidad de seguir disfrutando de la investigación, pudiendo compaginar mi trabajo en Murcia con la finalización de esta tesis doctoral, así como el apoyo de todos los compañeros del departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos del Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura. Por último, me gustaría resaltar la comprensión, la paciencia y el cariño de mi familia. A mis padres que siempre me enseñaron la honestidad y la perseverancia en el trabajo, les doy las gracias por sus esfuerzos. A mi padre, que desde donde esté nunca dejó de estar a mi lado. A mi madre por la eterna confianza que siempre depositó en mí y por compartir todas mis penas y alegrías. A mi hermano Julián y su esposa Almudena, que siempre me alentaron y me supieron ayudar. A mis tíos que siempre me desearon lo mejor. No menos importantes son todos aquellos amigos: Carlos, Manolo, Cristina, Virginia, Teresa, Sandra, María, Marta, Carolina, Jesús, Yolanda, Carmen, Eva, Lorena, Paula, María, Abigail, Patricia, Luis, Roberto, Manuel, José Antonio, Mar, Pepa, María, Pilar, Macarena, Natali, Devora, Laura, Luna, Alicia, Victoria, Choni, Ana, David, Paco, Juan, LLoao, Santiago, Fernando, Juan Carlos y Pedro, que no desfallecieron en sus ánimos, cariño y apoyo. Doy gracias a Dios por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente. VIRUS DE RNA DE DOBLE CADENA EN EPICHLOË FESTUCAE 2010 Índice Introducción ...................................................................................................................... 11 I. Los hongos endófitos ............................................................................................... 11 II. Los hongos endófitos de gramíneas ..................................................................... 12 III. Los endofitos sistémicos de gramíneas: Neotyphodium y Epichloë spp ...... 13 Taxonomía .......................................................................................................... 15 Ciclos de vida .................................................................................................... 16 Mutualismo en las interacciones entre endofitos sistémicos y gramíneas ........................................................................................................... 20 IV. Epichloë festucae .................................................................................................... 22 V. Los Virus .................................................................................................................... 23 VI. Origen de los virus de RNA ................................................................................... 24 VII. Los micovirus ............................................................................................................. 26 Características de los micovirus .................................................................. 26 Diversidad y clasificación en micovirus ...................................................... 27 Efectos producidos por infecciónes micovíricas ...................................... 29 VIII. Los micovirus de Epichloë festucae .............................................................. 31 IX. Bibliografía ................................................................................................................ 32 Objetivos ............................................................................................................................ 39 I. Objetivo general ...................................................................................................... 39 II. Objetivos específicos ............................................................................................. 39 Capítulo 1: Incidencia de RNAbc en poblaciones de E. festucae . 41 I. Introducción ............................................................................................................. 41 II. Materiales y métodos ............................................................................................. 43 Recolección de plantas y aislamiento de E. festucae. ............................. 43 Extracción de RNAbc. .................................................................................... 45 III. Resultados y discusión ............................................................................................ 46 Incidencia de RNAbc en aislados de E. festucae. .................................... 47 IV. Conclusiones .............................................................................................................. 51 Índice 5 2010 VIRUS DE RNA DE DOBLE CADENA EN EPICHLOË FESTUCAE V. Bibliografía ................................................................................................................ 52 Capítulo 2: Mecanismos de transmisión y persistencia de los virus de Epichloë festucae .................................................................................................. 55 I. Introducción ............................................................................................................. 55 Transmisión por anastomosis ........................................................................ 55 Transmisión a esporas sexuales y asexuales ............................................. 56 II. Materiales y métodos ............................................................................................. 58 Análisis de la transmisión por medio de esporas asexuales ................... 58 Transmisión por medio de esporas sexuales .............................................. 59 Relación entre la distancia genética y la presencia de virus en aislados de Epichloë festucae ....................................................................................... 60 III. Resultados y discusión ............................................................................................ 60 Transmisión vertical por esporas asexuales .............................................. 60 Transmisión por esporas sexuales ............................................................... 61 Persistencia de RNAbc en aislados de E. festucae .................................. 62 IV. Conclusiones .............................................................................................................. 64 V. Bibliografía ................................................................................................................ 65 Capítulo 3: Efectos fenotípicos de la infección de EfV1 y EfV2 .. 69 I. Introducción ............................................................................................................. 69 II. Materiales y métodos ............................................................................................. 71 Crecimiento radial ............................................................................................ 71 Efecto de la temperatura sobre el crecimiento de Epichloë festucae72 Efecto de la temperatura en la concentración celular de RNAbc ........ 72 III. Resultados y discusión ............................................................................................ 73 Efecto de la presencia de virus en el crecimiento de aislados ............. 73 Efecto de la temperatura de incubación en la concentración celular de virus .................................................................................................................... 80 Efecto de la temperatura de incubación en la biomasa .......................... 82 IV. Conclusiones .............................................................................................................. 85 V. Bibliografía ...............................................................................................................