Universidade de Brasília – UnB Instituto de Biologia Departamento de Botânica Análises de transcritoma e de metaboloma revelam que Qualea grandiflora Mart. possui um metabolismo Alumínio-dependente Renata Cristina Costa e Silva Orientador: Prof. Dr. Luiz Alfredo Rodrigues Pereira Brasília-DF Agosto – 2017 1 Universidade de Brasília – UnB Instituto de Biologia Departamento de Botânica Análises de transcritoma e de metaboloma revelam que Qualea grandiflora Mart. possui um metabolismo Alumínio-dependente Renata Cristina Costa e Silva Orientador: Prof. Dr. Luiz Alfredo Rodrigues Pereira Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Botânica da Universidade de Brasília como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. Brasília-DF Agosto – 2017 2 AGRADECIMENTOS À Deus, por permitir o meu caminhar em mais um passo e que me sustentou quando precisei do Seu amparo. Agradeço também pela vida do meu pai, que está ao nosso lado num momento tão importante, pela Sua permissão. A Ti toda honra e glória. À minha avozinha querida, Afonsina (in memorian), que me ensinou os verdadeiros valores da vida, através da sua simplicidade e fé. A senhora foi e sempre será o ser humano mais incrível que já conheci em toda a minha vida. À minha avó Nilza, pelas orações. Aos meus pais, João Teodoro e Maria Goretti, por aceitarem a difícil missão de me educar, por fazerem de mim uma pessoa melhor e por todo o apoio. A minha irmã, Chistiane, que sempre esteve ao meu lado em todos os momentos. Amo muito vocês! À minha tia Lúcia, por cuidar muito bem de mim em Brasília, como uma segunda mãe. Aos meus padrinhos, Iolanda e Idelfonso. Muito obrigada a vocês, pelas orações, ajuda e carinho em todos os momentos. Obrigada também por tanto amor, é reciproco. A toda a minha família, que esteve comigo e me fortaleceu para seguir adiante. Ao meu honey, Leandro Louza, que sempre esteve ao meu lado. Obrigada pela paciência descomunal, por me tranquilizar em momentos de prazos apertados. Te amo. À família do Leandro, Milson, Hermione e Leozinho, que me receberam muito bem em sua casa, fazendo dela a minha segunda casa e família. Ao meu orientador, Luiz Alfredo Rodrigues Pereira, que me orientou com toda a paciência e dedicação durante todo o mestrado e doutorado. Por toda a ajuda, sugestões e broncas nas reuniões; além das várias conversas que tivemos, que me tranquilizavam e mostravam que tudo daria certo. Muito obrigada pela confiança nesses sete anos de parceria. À minha amiga Michelle de Souza Fayad André, por toda ajuda e suporte durante a realização deste trabalho. Te conheci num momento tão inusitado, no final, aprendemos tanto com a vida e a pesquisa. Obrigada por fortalecer a minha fé e me fazer acreditar que daria certo. Sua parceria e amizade foram fundamentais. Aos companheiros e valentes amigos de laboratório e fora dele, Fábio Nakamura, Jessica Melo, Natália Cury, Juliane Laner, Darislene Moreira, Jéssika Vieira, Débora Alcântara, Flaviani e João Pedro que me proporcionaram tardes de análises mais divertidas e reflexivas ao longo desses mais de seis anos, entre mestrado e doutorado. Foi muito bom tomar café e filosofar com vocês. Ao professor Thomas Williams, que permitiu as análises de GC/MS em laboratório e me deu todo suporte para que tudo fosse realizado com muita qualidade e confiabilidade. 3 À professora Simoni Campos e ao Gabriel Rocha Fernandes, por toda a parceria, sugestões, empenho e execução das análises trancritômicas. Ao pesquisador Gabriel Sérgio Costa Alves, por todo o suporte durante as análises bioinformáticas. Obrigada por me ensinar tudo com muita paciência. Você é um pesquisador exemplar! Aos professores Sérgio Amorim de Alencar, Francisco Aragão, Michelle Guitton Cotta, Eneida dos Santos Silveira e Marcelo Campos, que através das bancas, contribuíram pertinentemente no trabalho. Meus respeitosos agradecimentos. Manifesto aqui a minha gratidão a todos os professores, funcionários e amigos do Departamento de Botânica - UnB e de Ciências Genômicas e Biotecnologia - UCB. Agradeço também ao apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAP-DF (Fundo de Apoio à pesquisa). Por fim, agradeço a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para eu estar aqui hoje. " Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós " Antoine de Saint-Exupéry 4 Como é precioso o teu amor, ó Deus! Os homens encontram refúgio à sombra das tuas asas. Salmos 36:7 5 LISTA DE ABREVIAÇÕES ABA - Ácido abiscísico ABP - Proteína de ligação a auxina ADP - adenosina difosfato AMDIS - Software automatizado de descoberta e identificação espectral de massa ATP - Adenosina tri fosfato BIN - Principais categorias funcionais BR - Brassinoesteroide BWA - Alinhador de Burrows-Wheeler CDF - Formato de documento em computador cDNA - DNA complementar CE-MS - Espectrometria de massa por electroforese capilar CT - Controle cpSecA - Subunidade de translocase de proteína de tilacoide CTAB - Brometo de Cetil Trimethyl de Amônio DEG - Diferença de expressão gênica DNA - Ácido desoxirribonucleico EST - Etiqueta de sequência expressa ET - Etileno GA - Ácido giberélico GABA - Ácido Gama-Aminobutírico GC-MS - Espectrometria de massa por cromatografia gasosa GMD - Base de dados do Golm Metabolome GO - Ontologia gênica GSH - Glutationa GTP - Guanosina trifosfato IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia Estatística Imaging MS - Imagem química por espectrometria de massas IP6 - Hexafosfato JA - Ácido jasmônico KEGG - Kyoto Enciclopédia de Genes e Genomas KO - Ortologia do KEEG KOG - Clusters de grupos ortólogos eucarióticos de proteínas LaCTAD - Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho LC-MS - Espectrometria de massa por cromatografia líquida LecRKs - Receptoras de quinases de lectina M&S - Murashige e Skoog m/z - Razão massa sobre a carga MeV - Microscópio eletrônico de varredura MS - Espectrometria de massas MSTFA - N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo NCBI - Centro Nacional de Informação Biotecnológica NGS - Sequenciamento de nova geração NIST - Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia NMR - Espectroscopia de ressonância magnética nuclear NR - Proteína não redundante OA - Ácido orgânico ORF - Janela aberta de leitura 6 PC - Fitoquelatina PCR - Reação em cadeia de polimerase pH - Potencial Hidrogeniônico Pi - Fosfato inorgânico PIB - Proteínas translocadoras de metais PME - Pectina metil esterase RLKs - Receptor quinase RNA - Ácido ribonucleico RNAm - RNA mensageiro ROS - Espécies Reativas ao Oxigênio RPKM - Transcrição por milhão de reads mapeadas SA - Ácido salicílico SBP - Proteína de ligação ao selênio SOD - Superóxido dismutase SOLid - Sequenciamento por ligadura e detecção de oligonucleotídeos SRA - Arquivo de Leitura de Sequência TCA - Ciclo do ácido tricarboxílico UV - Ultravioleta 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Filogenia das angiospermas acumuladoras de Al (Adaptado de Jansen et al., 2002). ………………………………………………………………………………………………………..29 Figura 2. Qualea grandiflora Mart. (Vochysiaceae). A- Vista geral da árvore adulta; B- detalhes dos ramos; C- fruto fechado; D- fruto aberto; E- flor (Adaptado de Haridasan et al., 20081)…………………………………………………………………………...……………………31 CAPÍTULO I - Transcriptome Analysis to Investigate the Metabolic Role of Aluminum in Qualea grandiflora Mart. Figure 1. Qualea grandiflora seedlings at the 120th day of cultivation………………….…………..53 Figure 2. Plants of Q. grandiflora after 240th day of growth……………………..………..…...……57 Figure 3. Volcano scatter plots for differentially expressed genes (DEGs) in Q. grandiflora……………………………………………………………………………………….…..60 Figure 4. Distribution of differentially expressed transcripts in Q. grandiflora in response to Al, according to the biological processes in which they act………………………………………….….65 Figure 5. Distribution of differentially expressed transcripts in Q. grandiflora in response to Al, according to the cellular component……………………………………………………………..……………………………..65 Figure 6. Distribution of differentially expressed transcripts in Q. grandiflora in response to Al, according to the molecular functions………………………………..……………………………….66 Figure 7. Functional distribution of Al-responsive genes in Q. grandiflora leaves as determined by Mercator…………………………………………...…………………………………………………67 Figure 8. MapMan-derived chart showing the expression profiles of differentially expressed genes (DEGs). Differential expression patterns were determined based on log2FCs of mRNA transcripts from leaves from both treatments…………………………………………………………………….…………..…………..69 Figure 9. Diagram of Al and its association with cell wall synthesis and other cellular processes……………………………………………………………………………………..………79 Figure 10. Diagram representing the proposed roles of Al in peroxidation on the mitochondrial membrane and in cpSecA ATPase activation on thylakoid membranes, GSH induced by SBP protein in Q. grandiflora leaves Al-treated………………………………………………………….……….82 CAPÍTULO II - GC-MS-Based Metabolic Analysis Helps to Unravelling the Role of Aluminum (Al) in Qualea grandiflora Mart. (Vochysiaceae) Figure 1. Plants of Q. grandiflora at eight months of age. Note the visual differences between plants 8 on each treatment………………………………………………………..…………………………..111 Figure 2. Relative abundance of significative metabolites in Q. grandiflora roots of both treatments…………………………………………………………………………………….……..112 Figure 3. Relative abundance of metabolites in Q. grandiflora leaves of both treatments……………………………………………………………………………………...……112