UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO GENÉTICA E TOXICOLOGIA APLICADA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO E IN VIVO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FLORES DE Hibiscus tiliaceus L. Tese para obtenção do Título de Doutor em Genética e Toxicologia Aplicada. Elemar Gomes Maganha Orientadora: Dra. Jenifer Saffi CANOAS 2009 Livros Grátis http://www.livrosgratis.com.br Milhares de livros grátis para download. Este trabalho foi desenvolvido nas instalações do Laboratório de Genética Toxicológica da Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), e no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI), recebendo apoio financeiro da ULBRA, da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) e do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). 2 Aos meus pais, Edemar e Dinora pelo apoio necessário, por serem as pessoas mais maravilhosas do mundo. Obrigado pelo exemplo de vida, de fé, perseverança, e fundamentalmente de amor (amo vocês). 3 AGRADECIMENTOS A minha orientadora Prof. Dr.ª Jenifer Saffi pelas orientações, contribuições, sugestões, disponibilidade e por todas as experiências vividas durante este período de trabalho, e, principalmente, pela amizade em mais uma etapa de minha vida. Aos professores Dr. Marc F. Richter, Dr.ª Maria I. Melicchi, Dr. Renato Moreira Rosa que contribuíram de forma significativa para o desenvolvimento deste trabalho. A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, pelos conhecimentos transmitidos. À Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) pelo apoio financeiro na pesquisa e à Universidade de Erechim (URI) pela disponibilidade dos laboratórios. A TODOS os colegas de mestrado e doutorado pelo convívio e companheirismo, em especial, Giovanni Cignachi e Valéria Flores Peres pela amizade, auxílio técnico, disponibilidade e colaboração. A Roberta, Pâmela e Virginia pela amizade e colaboração na realização desta pesquisa. A toda minha família, meus pais, Edemar e Dinora, pela dedicação, preocupação, carinho, apoio e estímulo. Ao meu amor, Edna, pelo carinho, compreensão, paciência durante este período e principalmente pelo incentivo na realização deste doutorado. A todas as pessoas que, de alguma maneira, colaboraram nesta etapa de crescimento profissional e pessoal. E, especialmente, a Deus por ter me iluminado para finalizar este trabalho. 4 ÍNDICE GERAL LISTA DE FIGURAS................................................................................................. 7 LISTA DE TABELAS................................................................................................. 9 RESUMO..................................................................................................................... 10 ABSTRACT................................................................................................................. 11 I – INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12 1. A PLANTA Hibiscus tiliaceus L.............................................................................. 13 1.1 Generalidades........................................................................................................... 13 1.2 Composição Química .............................................................................................. 15 1.3 Uso na medicina tradicional..................................................................................... 18 2. PREPARAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS..................................................... 18 2.1 Extração por ultra-som............................................................................................. 19 3. ESTRESSE OXIDATIVO E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTES.... 21 3.1 Antioxidantes enzimáticos........................................................................................23 3.2 Antioxidantes não enzimáticos.................................................................................24 3.2.1 Flavonóides............................................................................................................25 4. MUTAGÊNESE E ANTIMUTAGÊNESE.............................................................30 5. A LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae COMO MODELO DE ESTUDO..... 32 5.1 Defesas antioxidantes da levedura Saccharomyces cerevisiae................................ 33 5.2 O estudo de substâncias com atividades pró-e/ou antioxidante – modelos in vivo e in vitro.................................................................................................................................35 5.3 Teste de mutação forward........................................................................................ 39 6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA....................................................................... 40 5 II – OBJETIVOS ......................................................................................................... 42 1. Objetivo geral............................................................................................................. 42 2. Objetivos específicos..................................................................................................42 III – CAPÍTULO I........................................................................................................43 Pharmacological evidences for the extracts and secondary metabolites from plants of the genus Hibiscus. 43 IV-CAPÍTULO II……………………………………………………………………. 82 Evaluation of the in vitro and in vivo biological activity of the ethanol extract of flowers of Hibiscus tiliaceus L.………………………………………………………………...82 V-DISCUSSÃO GERAL..............................................................................................114 VI – CONCLUSÕES.................................................................................................... 120 1. Conclusão Geral..........................................................................................................120 2. Conclusões Específicas...............................................................................................120 VII – PERSPECTIVAS................................................................................................122 VIII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................123 IX-ANEXOS..................................................................................................................144 Anexo 1-Avaliação da atividade antimicrobiana pelos métodos difusão em placa e concentração inibitória minina (CIM)............................................................................144 LISTA DE FIGURAS 6 I – INTRODUÇÃO Figura 1. Flor do Hibiscus tiliaceus L........................................................................... 14 Figura 2. Partes aéreas do Hibiscus tiliaceus L............................................................. 15 Figura 3. Estruturas químicas de alguns componentes isolados de Hibiscus tiliaceus L. na madeira, raízes, flores e frutos (Gros et al.,1985)......................................................16 Figura 4. Estrutura de fitoesteróides identificados do Hibiscus tiliaceus L (Rosa et al., 2006)...............................................................................................................................17 Figura 5. Esquema da Extração por Ultra-som (MELECCHI, 2005)........................... 21 Figura 6. Representação esquemática do balanço entre estresse oxidativo e os antioxidantes in vivo (Adaptado de HALLIWEL, 2008)............................................... 22 Figura 7. Estrutura química dos flavonóides e seus subgrupos mais importantes....... 27 Figura 8. Fases de crescimento de uma levedura selvagem quando iniciada em meio completo (Adaptado de FUGE & WERNER, 1997)......................................................33 Figura 9. Estrutura do radical livre DPPH.....................................................................37 Figura 10. Esquema do ensaio para medir atividades antioxidantes in vitro utilizando o sistema da xantina oxidase (OWEN et al., 1996)...........................................................38 Figura 11. Derivatização dos radicais hidroxila com o ácido salicílico, levando a formação de dois compostos estáveis 2,3- e 2,5-dihidroxi-ácido-benzóico (2,3-DHBA e 2,5 DHBA)......................................................................................................................39 Figura 12. Estrutura química dos análogos arginina e canavanina................................49 III – CAPÍTULO I Figure 1. Some biological compounds of H. syriacus: (1) scopoletin; (2) clemiscosin A; (3) clemiscosin C; (4) clemiscosin D; (5) structure of pentacyclic triterpenes; (6) syriacusin A…………….……………………………………………………………….76 Figure2. The metabolite 9,9´-O-feruloyl-(-)secoisolariciresinol, an cytotoxic compound from H. taiwanensis………………………………………………………………........77 Figure 3. Structure of delphinidin-3-glucoxyloside (1), the major anthocyanin from H.sabdariffa flowers, and protocatechuic acid (PCA)……………………………….…78 7 IV-CAPÍTULO II Figure 1. Survival Assay with cells of S. cerevisiae in stationary phase after treatment with ethanolic extract of Hibiscus tiliaceus L flowers against H2O2 toxicity. The results represent the average of the experiments carried out in triplicate. Data significant in relation to only H2O2 treated cells group at P<0.05; ** P<0.01/ One-way ANOVA Survival (%) Tukey's Multiple Comparison Test……………………………………..112 Figure 2.