i UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR DETECÇÃO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE VÍRUS EM MELANCIA E CONSTRUÇÃO DE NOVOS VETORES VIRAIS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM CÉLULAS DE INSETO. Mariana Senna Quirino Brasília/2015 ii UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR DETECÇÃO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE VÍRUS EM MELANCIA E CONSTRUÇÃO DE NOVOS VETORES VIRAIS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM CÉLULAS DE INSETO. Mariana Senna Quirino Orientador: Prof. Dr. Bergmann Morais Ribeiro Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Lucas Melo Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Biologia Molecular Brasília/2015 iii Ficha catalográfica iv MARIANA SENNA QUIRINO DETECÇÃO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE VÍRUS EM MELANCIA E CONSTRUÇÃO DE NOVOS VETORES VIRAIS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM CÉLULAS DE INSETO. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Biologia Molecular Aprovado em: 18 / 12 / 2015. BANCA EXAMINADORA: Prof. Dr. Bergmann Morais Ribeiro Professor Universidade de Brasília (UnB) Prof. Dr. Paulo Sérgio Torres Brioso Professor da Universidade Rural do Rio de Janeiro Drª. Simone da Graça Ribeiro Pesquisadora da Embrapa Profª Drª Rita de Cássia Pereira Carvalho Professora Universidade de Brasília (UnB) Profª Drª. Eliane Ferreira Noronha Professor Universidade de Brasília (UnB) MEMBRO SUPLENTE: Drª Michelle de Souza Fayad André Pesquisadora daUniversidade de Brasília (UnB) v AQUELE que habita no esconderijo do Altíssimo, à sombra do Onipotente descansará.Direi do SENHOR: Ele é o meu Deus, o meu refúgio, a minha fortaleza, e nele confiarei (Salmo 91). vi Dedico ao meu esposo Neto e filha Marianne, pelo carinho e amor. Vocês são muito importantes para mim! vii AGRADECIMENTOS Em tudo e por tudo devemos dar graças a Deus! À minha querida família, pelo apoio, compreensão, carinho e amor dedicado durante estes anos, entendendo minha ausência em vários momentos. Amo muito vocês!! Ao meu orientador Prof. Dr. Bergmann Morais Ribeiro pela oportunidade, pela ajuda, atenção e por contribuir para o meu crescimento profissional. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Fernando Lucas Melo pelas horas de ensinamento, dicas, por contribuir para o meu crescimento profissional e principalmente pela paciência. Aos amigos do laboratório, Lorena, Deborah, Mayarah. Claudinha, Daniel, Jhon, Miguel, Fabrício, Beto, Leonardo, pela convivência e por contribuírem com o meu crescimento profissional. Às amigas pelo incentivo e pela solidariedade nos momentos importantes dessa etapa: Anabele, Lorena, Briana, Deborah, Fábia e Jessica. Muito sucesso! Ao Prof. Dr. Renato de Oliveira Resende, pela atenção quando solicitado e por oportunizar o laboratório para desenvolver o capítulo I da minha tese. À Drª Anelise Orílio, sou muito grata, por toda ajuda e pelo carinho. Ao Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar da Universidade Federal do Tocantins, por estar sempre disposto a me ajudar e principalmente pelo incentivo nas horas difíceis. Aos membros da banca por aceitarem gentilmente a participar da minha Defesa de Tese e por contribuírem para o melhorar o trabalho. À Universidade de Brasília pela oportunidade de crescimento profissional. À CAPES, pelo apoio financeiro. A todos que de alguma forma contribuíram para a minha formação. viii Índice Lista de figura .......................................................................................................... xiv Lista de tabela .......................................................................................................... xvi Resumo geral ........................................................................................................... xvii Abstract .................................................................................................................. xviii Introdução geral ........................................................................................................ 19 Objetivo geral do capítulo I ...................................................................................... 21 Objetivo geral do capítulo II..................................................................................... 21 CAPÍTULO I............................................................................................................. 22 Resumo ...................................................................................................................... 23 Abstract ..................................................................................................................... 24 1 Introdução .............................................................................................................. 25 1.1Aspectos gerais da cultura da melancia............................................................... 27 1.2 Características gerais das famílias de vírus que infectam melancia ................. 31 1.2.1 Família Bromoviridae ......................................................................................... 31 1.2.2 Família Bunyaviridae ......................................................................................... 32 1.2.3 Família Closteroviridae ...................................................................................... 34 1.2.4 Família Geminiviridae ........................................................................................ 35 1.2.5 Família Luteoviridae .......................................................................................... 36 1.2.6 Família Potyviridae ............................................................................................ 37 1.2.7 Família Secoviridae ............................................................................................ 40 1.2.8 Família Partitiviridae ......................................................................................... 41 ix 1.2.9 Família Tombusviridae ....................................................................................... 42 1.2.10 Família Virgaviridae ........................................................................................ 44 1.3 Metagenômica ..................................................................................................... 45 1.4 Sequenciamento de alto desemepnho ................................................................. 46 1.4.1 Amplificação (PCR) fase sólida .......................................................................... 47 2 Justificativa ............................................................................................................ 49 3 Objetivos ................................................................................................................. 50 3.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 50 3.2 Objetivos específicos............................................................................................. 50 4 Materiais e métodos ............................................................................................... 51 4.1 Plantas de melancia ............................................................................................. 51 4.2 Partículas virais ................................................................................................... 53 4.2.1 Técnica de leaf dip ............................................................................................. 53 4.2.2 Purificação viral e extração de RNA ................................................................... 53 4.3 Sequenciamento de alto desempenho ................................................................. 53 4.3.1 Triagem, montagem e análise dos contigs ........................................................... 53 4.3.2 Anotação do genoma viral .................................................................................. 54 4.3.3 Análise da distribuição de diversidade dos genomas ........................................... 54 4.3.4 Análise filogenética ............................................................................................ 55 4.4 Extração de RNAs ............................................................................................... 55 4.4.1 Extração de RNA total........................................................................................ 55 4.4.2 Montagem do ensaio e extração de dsRNA em plantas assintomáticas ................ 55 4.5 Detecção por PCR ............................................................................................... 56 x 4.5.1. Construção de oligonucleotídeos específicos ..................................................... 57 4.5.2 RT-PCR ............................................................................................................. 59 4.6 Confirmação por clonagem e sequenciamento (Sanger) .................................... 60 4.7 Inoculação experimental ..................................................................................... 61 4.8 Detecção por dot-ELISA em plantas hospedeiras .............................................. 63 4.9 Detecção por RT-PCR no ensaio de plantas hospedeiras .................................. 63 5 Resultados e discussão ........................................................................................... 64 5.1 Identificação de vírus