MEFs und MORFs: Charakterisierung von Vertretern zweier Arten von RNA-Editing-trans- Faktoren Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm vorgelegt von Barbara Härtel aus Kempten Ulm 2013 Die Arbeiten im Rahmen der vorgelegte Dissertation wurden in der Zeit von März 2010 bis Januar 2013 am Institut für Molekulare Botanik der Universität Ulm durchgeführt und von Herrn Prof. Dr. Axel Brennicke betreut. Amtierender Dekan der Fakultät für Naturwissenschaften: Prof. Dr. Joachim Ankerhold Erstgutachter: Prof. Dr. Axel Brennicke, Institut für Molekulare Botanik, Universität Ulm Zweitgutachter: PD Dr. habil. Mizuki Takenaka, Institut für Molekulare Botanik, Universität Ulm Tag der Promotion: “Science is wonderfully equipped to answer the question ‘How?’ but it gets terribly confused when you ask the question ‘Why?’ “ (Erwin Chargaff, 1977) Inhaltsverzeichnis | 1 Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................................... 4 II Zusammenfassung ................................................................................................................................ 7 III Summary ................................................................................................................................................... 8 IV Einleitung ................................................................................................................................................. 9 IV.1 RNA-Editing in Landpflanzen .................................................................................................... 9 IV.2 Potentielle Vorteile des RNA-Editing in Pflanzen ........................................................... 10 IV.3 Evolution des RNA-Editing in Pflanzen ............................................................................... 12 IV.4 Erkennung der RNA-Editingstellen ...................................................................................... 13 IV.5 Ansätze zur Identifizierung von RNA-Editing-trans-Faktoren .................................. 14 IV.6 PPR-Proteine ................................................................................................................................. 15 IV.7 Der „PPR-Code“ ............................................................................................................................. 16 IV.8 DAL- bzw. MORF-Proteine........................................................................................................ 17 IV.9 Mögliche Mechanismen des RNA-Editings in Pflanzen ................................................. 19 IV.10 Aufklärung der potentiellen Funktion des Maturase-ähnlichen Gens matR durch RNA-Editing-Mutanten .......................................................................................................................... 21 IV.11 Zielsetzung dieser Arbeit .......................................................................................................... 23 V Material und Methoden ..................................................................................................................... 25 V.1 Material ............................................................................................................................................ 25 V.1.1 Organismen ........................................................................................................................... 25 V.1.2 Vektoren ................................................................................................................................. 25 V.1.3 Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und kommerzielle Kits .......................... 26 V.1.4 Enzyme ................................................................................................................................... 26 V.1.5 Mono- und Oligonukleotide ............................................................................................ 26 V.1.6 Geräte ...................................................................................................................................... 27 V.1.7 Datenbanken und Analyseprogramme ...................................................................... 27 V.2 Methoden ........................................................................................................................................ 28 Inhaltsverzeichnis | 2 V.2.1 Standardmethoden der Molekularbiologie .............................................................. 28 V.2.2 EMS-Mutanten ..................................................................................................................... 29 V.2.3 T-DNA-Insertionslinien .................................................................................................... 29 V.2.4 Protoplastentransformation .......................................................................................... 29 V.2.5 Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana .................................................. 30 V.2.6 Bestimmung der Editingeffizienz ................................................................................. 30 V.2.7 Transiente Transformation von Epidermiszellen von Nicotiana benthamiana .......................................................................................................................................... 30 V.2.8 Konstrukte für die bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation (BiFC) .... 31 V.2.9 Untersuchung des Splicing-Status mitochondrialer Transkripte .................... 31 VI Ergebnisse .............................................................................................................................................. 33 VI.1 Charakterisierung mehrerer PPR-Proteine als RNA-Editing-trans-Faktoren ...... 33 VI.1.1 Identifizierung durch EMS-Mutanten: MEF10, MEF12 und MEF13 ............... 33 VI.1.2 Identifizierung durch T-DNA-Insertionslinien: MEF28 und MEF30 .............. 41 VI.2 Untersuchung der RNA-Editing-Effizienz aller chloroplastidären Stellen in den Mutanten von morf2, morf9 und morf5 ........................................................................................... 44 VI.3 Analyse potentieller Interaktionen verschiedener RNA-Editing-trans-Faktoren durch BiFC................................................................................................................................................... 47 VI.3.1 Intrazelluläre Lokalisation der MORF-Proteine ..................................................... 47 VI.3.2 Bildung von Homo-und Heterodimeren zwischen MORF-Proteinen ............. 49 VI.3.3 Interaktionen einiger PPR-Proteine mit MORF-Proteinen ................................. 54 VI.4 Analyse des Splicing-Status mitochondrialer Transkripte in matR-Editing- Mutanten ..................................................................................................................................................... 58 VII Diskussion .......................................................................................................................................... 61 VII.1 Charakterisierung mehrerer PPR-Proteine als RNA-Editing-trans-Faktoren ...... 61 VII.1.1 Identifizierung durch EMS-Mutanten: MEF10, MEF12 und MEF13 ........... 61 VII.1.2 Identifizierung durch T-DNA-Insertionslinien: MEF28 und MEF30 .......... 63 Inhaltsverzeichnis | 3 VII.2 Untersuchung der RNA-Editing-Effizienz aller chloroplastidären Stellen in den Mutanten von morf2, morf9 und morf5 ........................................................................................... 65 VII.3 Analyse potentieller Interaktionen verschiedener RNA-Editing-trans-Faktoren durch BiFC................................................................................................................................................... 67 VII.3.1 Intrazelluläre Lokalisation der MORF-Proteine ................................................. 67 VII.3.2 Bildung von Homo-und Heterodimeren zwischen MORF-Proteinen ........ 67 VII.3.3 Interaktionen einiger PPR-Proteine mit MORF-Proteinen ............................ 69 VII.4 Analyse des Splicing-Status mitochondrialer Transkripte in matR-Editing- Mutanten ..................................................................................................................................................... 70 VIII Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 72 IX Publikationsliste .................................................................................................................................. 82 IX.1 Publikationen ................................................................................................................................ 82 IX.2 Reviews ............................................................................................................................................ 82 IX.3 Kongressvorträge ........................................................................................................................ 82 IX.4 Poster ................................................................................................................................................ 83 X Publikationen ........................................................................................................................................ 85 XI Curriculum Vitae.................................................................................................................................