공개특허 10-2011-0007666 (19) 대한민국특허청(KR) (11) 공개번호 10-2011-0007666 (12) 공개특허공보(A) (43) 공개일자 2011년01월25일 (71) 출원인 (51) Int. Cl. 한국해양연구원 C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01) 경기 안산시 상록구 사동 1270번지 (21) 출원번호 10-2009-0065213 (주)지노첵 (22) 출원일자 2009년07월17일 경기도 안산시 사1동 1271 한양대학교 창업보육센 심사청구일자 2009년07월17일 타 630호 (72) 발명자 이윤호 서울 강남구 도곡1동 961번지 현대아파트 2동 1011호 김충곤 경기도 용인시 수지구 상현동 만현마을 현대아이 파크 10단지 1002동 1401호 (뒷면에 계속) (74) 대리인 진천웅, 정종옥, 조현동 전체 청구항 수 : 총 12 항 (54) 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트 (57) 요 약 본 발명은 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것 으로, 해양생물로부터 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산 물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다. 이러한 본 발명은 다양한 해양생물 종의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 기반으로, 해양생물에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 효과가 있다. 대 표 도 - 도2 - 1 - 공개특허 10-2011-0007666 (72) 발명자 황승용 배세진 경기 안산시 단원구 고잔동 호수공원아파트 116동 경기도 안산시 단원구 고잔동 호수공원대림아파트 1202호 108동 702호 정진욱 김성 서울특별시 구로구 고척1동 334번지 벽산블루밍아 경기도 안산시 상록구 사2동 1429번지 301호 파트 206동 901호 정다금 김예림 충북 청주시 흥덕구 운천동 1296번지 경기도 안산시 상록구 본오3동 신안2차아파트 201 동 903호 김고은 윤현규 서울특별시 마포구 도화동 마포삼성아파트 108동 1601호 서울 양천구 신월3동 188-8 박흥식 서울특별시 동대문구 답십리1동 대우아파트 102동 1502호 - 2 - 공개특허 10-2011-0007666 특허청구의 범위 청구항 1 해양생물로부터 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염 기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 해양생물 종의 판 별 방법. 청구항 2 제1항에 있어서, 상기 해양생물은 자리돔, 미역치, 황놀래기, 범돔, 용치놀래기, 개볼락, 돌돔, 매끈이고둥, 끄 덕새우, 지중해담치, 홍합, 분홍성게, 둥근성게, 새치성게, 말똥성게, 멸치, 태평양고등어, 망치고등어, 대서양 고등어, 대구, 말쥐치, 살오징어, 바위굴, 참굴, 홍게, 대게, 소라, 납작소라 및 앨퉁이로 이루어진 군에서 적 어도 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 3 제1항에 있어서, 상기 추출한 DNA는 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNPs)을 포함하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 4 제1항에 있어서, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 것은, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 자리돔(Chromis notata)으로 판별하고, 서열번 호 10의 프로브와 결합하는 경우에는 미역치(Paracentropogon rubripinnis)로 판별하고, 서열번호 11의 경우에 는 황놀래기(Pseudolabrus japonicus), 서열번호 12의 경우는 범돔(Microcanthus strigatus), 서열번호 13의 경우는 용치놀래기(Halichoeres poecilopterus), 서열번호 14의 경우는 개볼락(Sebastes pachycephalus), 서열 번호 15의 경우는 돌돔(Oplegnathus fasciatus), 서열번호 16의 경우는 매끈이고둥(Kelletia lischkei), 서열 번호 17 및 서열번호 18의 경우는 끄덕새우(Rhynchocinetes uritai), 서열번호 19의 경우는 지중해담치 (Mytilus galloprovincialis), 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 홍합(Mytilus coruscus), 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 분홍성게(Pseudocentrotus depressus), 서열번호 24의 경우는 둥근성게 (Stronylocentrotus nudus), 서열번호 25의 경우는 새치성게(Stronylocentrotus intermedius), 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus), 서열번호 28의 경우는 멸치(Engraulis japonicus), 서열번호 29번의 경우는 태평양고등어(Scomber japonicus), 서열번호 30의 경우는 망치고등어 (Scomber australasicus), 서열번호 31의 경우는 대서양고등어(Scomber scombrus), 서열번호 32의 경우는 대구 (Gadus macrocephalus), 서열번호 33의 경우는 말쥐치(Thamnaconus modestus), 서열번호 34의 경우는 살오징어 (Todarodes pacificus), 서열번호 35의 경우는 바위굴(Crassostrea nippona), 서열번호 36의 경우는 참굴 (Crassostrea gigas), 서열번호 37의 경우는 홍게(Chionoecetes japonica), 서열번호 38의 경우는 대게 (Chionoecetes opilio), 서열번호 39의 경우는 소라(Batillus cornutus), 서열번호 40의 경우는 납작소라 (Pomaulax japonicus), 서열번호 41의 경우는 앨퉁이(Maurolicus japonicus)로 판별하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 5 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하고, 상기 결합은 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별방 - 3 - 공개특허 10-2011-0007666 법. 청구항 6 제5항에 있어서, 상기 결합이 상기 해양생물 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브는 자리돔 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 552-576번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 10의 프로브는 미역치 종의 532-556번째 DNA 서열, 서열 11의 경우 는 황놀래기 종의 397-421번째 DNA 서열, 서열 12의 경우는 범돔 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경 우는 용치놀래기 종의 547-571번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 개볼락 종의 486-513번째 DNA 서열, 서열번 호 15의 경우는 돌돔 종의 510-534번째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 매끈이고둥 종의 484-517번째 DNA 서열, 서열번호 17 및 서열번호 18의 경우는 각각 끄덕새우 종의 420-443번째 DNA 서열과 359-382번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 지중해담치 종의 257-280번째 DNA 서열, 서열번호 20 및 서열번호 21의 경우는 각 각 홍합 종의 366-389번째 DNA 서열과 492-515번째 DNA 서열, 서열번호 22 및 서열번호 23의 경우는 각각 분홍 성게 종의 366-389번째 DNA 서열과 493-516번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 둥근성게 종의 482-505번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 새치성게 종의 320-341번째 DNA 서열, 서열번호 26 및 서열번호 27의 경우는 각각 말똥성게 종의 367-390번째 DNA 서열과 520-543번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 멸치 종의 322-345번 째 DNA 서열, 서열번호 29번의 경우는 태평양고등어 종의 512-534번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 망치고 등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 대서양고등어 종의 511-534번째 DNA 서열, 서열번호 32 의 경우는 대구 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 말쥐치 종의 581-603번째 DNA 서열, 서열번 호 34의 경우는 살오징어 종의 602-623번째 DNA 서열, 서열번호 35의 경우는 바위굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 36의 경우는 참굴 종의 349-372번째 DNA 서열, 서열번호 37의 경우는 홍게 종의 584-610번째 DNA 서열, 서열번호 38의 경우는 대게 종의 549-575번째 DNA 서열, 서열번호 39의 경우는 소라 종의 341-373번 째 DNA 서열, 서열번호 40의 경우는 납작소라 종의 518-547번째 DNA 서열, 서열번호 41의 경우는 앨퉁이 종의 396-416번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 7 제1항에 있어서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 8 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택된 적 어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클 레오티드를 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하는 해양생물 종의 판별 방법. 청구항 9 서열번호 9 내지 서열번호 41 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인 (complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 해양생물 종 판별 용 프로브. 청구항 10 서열번호 9 내지 서열번호 41 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보 적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함하는 해양생물 종 판별용 DNA 칩. - 4 - 공개특허 10-2011-0007666 청구항 11 해양생물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 9 내지 서열번호 40 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열 로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 해양생물의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특 징으로 하는 해양생물 종 판별용 키트. 청구항 12 제11항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열 과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 인 것을 특징으로 하는 해양생물 종 판별용 키트. 명 세 서 발명의 상세한 설명 기 술 분 야 [0001] 본 발명은 해양생물의 종을 판별하기 위한 것으로, 특히 다양한 해양생물 종의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)을 기반으로, 해양생물에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 해양생물의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것 이다. 배 경 기 술 [0002] 국내외 종래의 생물종 분류연구는 형태의 계측형질, 계수형질을 바탕으로 하고 있다. [0003] 근래에는 형태형질을 이용한 분류 및 계통연구에 많은 문제점들이 발견되어 분자생물학적 기법이 활발하게 도 입되고 있다. 이 방법은 성체를 중심으로 이루어진 기존의 형태분류의 단점을 보완하는 것으로 발생초기 생물 종 혹은 가공된 개체의 경우와 비교할 수 있어 이점으로 작용하고 있다. [0004] 하지만 생물다양성 조사를 위한 다양한 생물종을 한번에, 그리고 신속 정확하게 판별할 수 있는 분자 생물학적 인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다. 발명의 내용 해결 하고자하는 과제 [0005] 본 발명은 다양한 해양생물 종에 대한 유전자형을 분석하여, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것이 목적이다. [0006] 또한, 본 발명은 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 치어(稚魚) 또는 사체 조각 등에 대해서, 하나의 슬라이 드 위에 해양생물 시료를 올려 놓는 것만으로도 그 종을 판별할 수 있는 해양생물 판별용 프로브, 이를 포함하 는 DNA 칩 또는 키트를 제공하기 위한 것이다. - 5 - 공개특허 10-2011-0007666 [0007] 또한, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있는 수단을 제공하고자 한다. 과제 해결수단 [0008] 상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 해양생물 종의 판별 방법은, 해양생물로부터 추출한 DNA 에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 9 내지 서열번호 41의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 해양생물이 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 특 징이다. [0009] 그리고, 본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 9 내지 서열번호 41 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오 티드로 이루어진 해양생물 종 판별용 프로브일 수 있다. [0010] 또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 9 내지 서열번호 41 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함 하는 해양생물 종 판별용 DNA 칩인 것도 가능하다.