INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Efeito do extrato etanólico e frações de Nidularium procerum Lindman sobre a resposta alérgica pulmonar em camundongos. Alessandra Mendonça Siqueira Orientador: Prof. Dr.: Valber da Silva Frutuoso RIO DE JANEIRO 2013 i INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Alessandra Mendonça Siqueira Efeito do extrato etanólico e frações de Nidularium procerum Lindman sobre a resposta alérgica pulmonar em camundongos. Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências na área de Biologia Celular e Molecular. Orientador: Prof. Dr.: Valber da Silva Frutuoso RIO DE JANEIRO 2013 ii iii INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Alessandra Mendonça Siqueira Efeito do extrato etanólico e frações de Nidularium procerum Lindman sobre a resposta alérgica pulmonar em camundongos. ORIENTADOR: Prof. Dr.: Valber da Silva Frutuoso Aprovada em: 26/08/2013 EXAMINADORES: Prof. Dra.: Patrícia Machado Rodrigues e Silva Martins Prof. Dra.: Christianne Bandeira de Melo Prof. Dra.: Edna Alves dos Anjos Valotta Prof. Dra.: Carmen Penido Monteiro (revisora e suplente) Prof. Dra.: Monica Farah Pereira (suplente) Rio de Janeiro, 26 de agosto de 2013. iv Agradecimentos Á Deus, por tudo que representa na minha vida, pela força nos momentos que eu pensei em desistir e pela sua proteção. A minha família: aos meus pais e irmãos, pelo apoio, nessa minha jornada. Não tenho palavras para agradecer tudo que vocês fizeram e ainda fazem por mim. Ao meu marido, pelo apóio e paciência. Amo muito todos vocês. Ao meu orientador Dr. Valber da Silva Frutuoso por me permitir realizar esta tese pela confiança e imensa paciência. Ao Dr. Hugo Castro de Faria-Neto e á Dra. Patrícia Torres Bozza, por terem me permitindo ingressar no laboratório e realizar este trabalho. A todos os componentes do laboratório de imunofarmacologia, em especial a galera dos produtos naturais pelas dicas e pela ajuda preciosa durante este trabalho, Diogo Dibo do Nascimento, Andrea Surrage, Cristiane Zanon, Julliana Azevedo, Nathália Costa, Ana Karina Furtado, Diego Mendes. Vou sentir falta da companhia e das gordices. A Dra. Maria Raquel Figueiredo e a Ms. Cristiane Cardoso dos Santos e Flávia da Cunha Camillo do laboratório de produtos naturais três, em Farmanguinhos pela colaboração e fornecimento dos extratos de Nidularium procerum. Muito obrigada. Ao laboratório de inflamação pelas dicas com os experimentos, por prontamente esclarecem muitas dúvidas que tive. Em especial, Dra. Priscila Olsen, Dra. Tatiana Paula Teixeira Ferreira, Rafaelle Rodrigues de Almeida, Daiana Cristina Oliveira dos Santos, Ana Carolina Santos de Arantes, Dr. Vinicius de Frias Carvalho, Dr. Marco Aurélio Martins e Dra. Patrícia Machado Rodrigues e Silva Martins. A Dra. Christianne Bandeira de Melo, Dra. Tatiana Luna e Rafaele Samico pelos experimentos com os eosinófilos. Obrigado pela pronta ajuda e por eu ter aprendido muito com vocês. A Dra. Marcia Oliveira pelos experimentos com os mastócitos, obrigada por compartilhar seus conhecimentos e pela simpatia. Aos meus amigos pela força, carinho e companheirismo. A pós-graduação de Biologia Celular e Molecular, pelo ensino e apoio. A secretária Daniele Lobato e ao coordenador Dra. Leila Mendonça Lima pela competência com relação aos alunos. A CAPES, FINEP, CNPq, Fiocruz e as instituições de fomento pelo apoio financeiro. Enfim, a todos aqueles que colaboraram direta e indiretamente para esse trabalho. v Que Deus abençoe a todos vocês, e mais uma vez muito obrigada!!!!! Um ao outro ajudou, e ao seu companheiro disse: Esforça-te. Isaías 41:6. vi “Os planos fracassam por falta de conselho, mas são bem-sucedidos quando há muitos conselheiros.” Provérbios 15:22 vii Lista de tabelas Página Tabela 1 Classificação taxonômica de Nidularium procerum. 17 Tabela 2 Grupos de animais para o tratamento oral. 25 Tabela 3 Grupos de animais para o tratamento via areolização. 26 Tabela 4 Quantidade de endotoxina nos extratos/subfrações. 69 Tabela 5 Resumo do efeito do extrato/subfrações nos experimentos 90 in vitro. viii Lista de figuras Página Figura 1 Quadro ilustrativo do manejo da asma. 9 Figura 2 Distribuição geográfica da família Bromeliaceae. 16 Figura 3 Distribuição geográfica do gênero Nidularium no Brasil. 17 Figura 4 Nidularium procerum. 17 Figura 5 Esquema de protocolo e análises no modelo de inflamação alérgica 23 pulmonar. Figura 6 Esquema de protocolo e análises no modelo de Inflamação Alérgica 24 Pulmonar, asma estabelecida, caracterização. Figura 7 Esquema de protocolo e análises no modelo de Inflamação Alérgica 24 Pulmonar, asma estabelecida, caracterização e tratamento. Figura 8 Esquema de protocolo e análises no modelo de Inflamação Alérgica 25 Pulmonar Crônica. Figura 9 Esquema de protocolo e análises do cultivo de esplenócitos. 31 Figura 10 Esquema de protocolo e análises do cultivo de mastócitos. 32 Figura 11 Esquema de protocolo e análises do cultivo de eosinófilos. 34 Figura 12 Efeito de NpEt sobre a celularidade no lavado bronco alveolar 39 (BAL) de camundongos submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica. Figura 13 Efeito do tratamento com NpEt sobre o acúmulo de proteínas no 40 BAL de camundongos submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica. Figura 14 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 41 modelo de inflamação pulmonar alérgica (coloração com H&E). Figura 15 Análise do infiltrado peribronquiolar nos pulmões de camundongos 42 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica (coloração com H&E). Figura 16 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 43 modelo de inflamação pulmonar alérgica (coloração com PAS). Figura 17 Análise da produção de muco em pulmões de camundongos 43 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica (coloração com PAS). ix Figura 18 Efeito do tratamento com NpEt sobre a hiperreatividade brônquica 44 em camundongos submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica, através do sistema de BUXCO invasivo. Figura 19 Efeito de NpEt sobre a celularidade na medula de camundongos 45 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica. Figura 20 Efeito de NpEt sobre a celularidade no sangue de camundongos 46 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica. Figura 21 Efeito de NpEt sobre da liberação de IgE no soro de camundongos 47 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica. Figura22 Análise da celularidade no BAL de camundongos submetidos ao 48 modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 23 Análise do acúmulo de proteínas no BAL de camundongos 49 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 24 Análise de EPO no BAL de camundongos submetidos ao modelo de 49 inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 25 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 50 modelo de inflamação pulmonar alérgica por coloração com H&E, após três dias de aerolização. Figura 26 Análise do infiltrado celular nos pulmões de camundongos 50 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica por coloração com H&E, após três dias de aerolização. Figura 27 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 51 modelo de inflamação pulmonar alérgica por coloração com PAS, após três dias de aerolização. Figura 28 Análise da produção de muco em pulmões de camundongos 51 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica por coloração com PAS, após três dias de aerolização. Figura 29 Análise da liberação de citocinas e da quimiocina RANTES no BAL 53 de camundongos submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 30 Análise da liberação de eotaxina, CisLt e PGD2 no BAL em 54 camundongos submetidos ao modelo de inflamação pulmonar, após x três dias de aerolização. Figura 31 Análise da celularidade na medula de camundongos submetidos ao 55 modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 32 Análise da celularidade no sangue de camundongos submetidos ao 55 modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 33 Análise hiperreatividade brônquica em camundongos submetidos ao 56 modelo de inflamação pulmonar, através do sistema de BUXCO não invasivo, após três dias de aerolização. Figura 34 Análise da liberação de IgE no soro de camundongos submetidos ao 56 modelo de inflamação pulmonar alérgica, após três dias de aerolização. Figura 35 Efeito de NpEt sobre a celularidade no BAL de camundongos 58 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica de camundongos e aerolizados por três dias (3x) ou aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h após (6x). Figura 36 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 59 modelo de inflamação pulmonar alérgica aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h após (coloração com H&E). Figura 37 Análise do infiltrado peribronquiolar em pulmões de camundongos 60 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica, aerolizados por aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h após (coloração com H&E). Figura 38 Imagens representativas de pulmões de camundongos submetidos ao 61 modelo de inflamação pulmonar alérgica, aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h após (coloração com PAS). Figura 39 Análise da produção de muco em pulmões de camundongos 61 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica, aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h após (coloração com PAS). Figura 40 Efeito de NpEt sobre a celularidade no BAL de camundongos 62 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica de camundongos e aerolizados por três dias (3x) ou aerolizados por seis xi dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h (1x) e 8h (2x) após (6x). Figura 41 Efeito de NpEt sobre a liberação de EPO no BAL de camundongos 62 submetidos ao modelo de inflamação pulmonar alérgica e aerolizados por três dias (3x) ou aerolizados por seis dias e tratados partir do 4º dia de desafio 1h (1x) e 8h (2x) após (6x).