République Algérienne Démocratique et Populaire ار اا ااط ا Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique وزارة ا ا وا ا Institut National Agronomique El Harrach - Alger ا اط# م ا! – ااش - اا Thèse Présentée par BOUNAR Rekia En vue de l'Obtention du diplôme de Magister en Sciences Agronomiques Option : Phytopathologie et Amélioration Génétiques de la Résistance des Plantes aux Maladies THEME Recherche sur l'état sanitaire de s semences de céréales et de légumineuses alimentaires : Mise en évidence des mycotoxines et leur effet sur la germination Devant le jury composé de : Président : Mr. BELLAL M. Professeur INA El Harrach Directeur de thèse : Mr. BOUZNAD Z. Professeur INA El Harrach Examinateurs : Mr. LAROUS L . Professeur UFA Sétif Mr. GUERMOUCHE M. Professeur U.S.T.H.B. Mr. KEDAD A. Docteur INA El Harrach Année Universitaire 2008 / 2009 SOMMAIRE Pages Liste des abréviations ……………………………………………………………………………… 1 Liste des tableaux ……………………………………………………………………………………. 2 Liste des figures ……………………………………………………………………………………… 3 INTRODUCTION …………………………………………………………………………………… 5 I. DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ……………………………………………………… 8 A. Mycoflore ……………………………………………………………………………………… 8 1. Généralités sur les champignons toxinogènes portés par les semences………………………… 10 2. Importance des champignons phytopatogènes transmis par les semences……………………. 11 3. Conditions de développement de la mycoflore portée par les semences……………………… 12 3.1. Facteurs physico-chimiques………………………………………………………………… 12 3.2. Facteurs biologiques……………………………………………………………………….. 13 B. Mycotoxines ……………………………………………………………………………………. 13 1. Présentation des principales mycotoxines des grains………………………………………….. 14 2. Origines et principaux mécanismes d’élaboration des mycotoxines………………………...... 15 3. Facteurs de production des mycotoxines………………………………………………………. 15 4. Mycotoxines et mycotoxicoses………………………………………………………………… 16 4.1. Mode d'action des mycotoxines………………………………………………………… 16 4.2. Effets néfastes des mycotoxines sur la santé des consommateurs……………………… 16 … 5. Aflatoxines………………………………………………………………………………......... 17 5.1. Structure et propriétés physico-chimiques……………………………………………… 18 5.2. Les voies de biosynthèse des aflatoxines………………………………………………. 19 5.3. Métabolisation et élimination des aflatoxines………………………………………….. 19 6. Principales méthodes de détection des mycotoxines dans les grains………………………….. 20 6.1. Méthodes biologiques ………………………………………………………………….. 20 6.2. Méthodes immunologiques…………………………………………………………….. .. 21 6.3. Méthodes physico-chimiques…………………………………………………………… 21 7. Prévention et procédés de décontamination………………………………………………….. 21 8. Législation……………………………………………………………………………………. 23 II. Matériel et méthodes ………………………………………………………………………….. 25 2.1. Matériel végétal………………………………………………………………………. 25 2.2. Matériel bactériologique ………………………………………………………………. 26 2.3. Méthodes d’analyse sanitaire des semences…………………………………………… 26 2.3.1. Contrôle de la viabilité des graines …………………………….…………......…... 26 S1 2.3.1. Contrôle de la viabilité des graines …………………………….…………......…....................... 26 2.3.2. Détermination de la teneur en eau des échantillons………………………….....…........ 27 2.3.3. Isolement et purification de la mycoflore totale associée aux semences ..................... 27 2.3.4. Identification de la mycoflore associée aux semences………………………............. 28 2.3.5. Description des caractères morphologiques et microscopiques des espèces toxinogènes.………………………………………………………….….…….......…........ 29 2.4. Effet de la mycoflore sur la faculté germinative des grains…………………....….…....... 29 2.5. Techniques analytiques pour la recherche des aflatoxines dans les grains…….…............. 30 2.6. Test d'activité biologique des filtrats de culture…………………………..…..................... 30 2.7. Méthodes physiques de séparation et d’analyse des aflatoxines………………….……...... 38 2.8. Test des aflatoxines comme herbicide naturel…………………………………….…........ 45 III. Résultats et interprétations 3.1. Contrôle de la viabilité et détermination du taux d'humidité des échantillons …....….….... 48 3.2. Evaluation de la mycoflore totale.................................................................................…...... 49 3.3. Recensement de la mycoflore interne des lots analysés de céréales et de légumineuses....... 60 3.4. Distribution de la contamination fongique dans les différentes parties de la graine.............. 60 3.5. Description des Aspergillus flavus et parasiticus sur différents milieux de culture......….... 67 3.6. Description des Aspergillus flavus et parasiticus selon la méthode de Pitt et Hocking....... 70 3.7. Effet de la mycoflore sur la germination des grains……………………………………...... 71 3.8. Résultats de la fluorescence jaune verdâtre (BGYF) au niveau des grains d’arachides......... 79 3.9. Test biologique de production d’aflatoxine.……………………….…………………........... 79 3.9.1. Mise en évidence des espèces aflatoxinogènes……………………………….…....... 79 3.9.2. Test d’activité biologique des filtrats de culture…………………………………........ 82 a) Effet des filtrats de culture sur la croissance bactérienne.…………..……………...... 82 b) Effet de filtrat de culture sur la germination des grains de quelques plantes.…............. 83 3.10. Production de métabolites secondaires excrétés dans le milieu YES liquide……............. 84 3.11. Production de métabolites secondaires élaborés dans le milieu YES solide…….............. 86 3.12. Métabolites secondaires détectés dans les grains d'arachides……………………............. 89 3.13. Confirmation de l'identité d'aflatoxine………………………………………….....…....... 91 3.14. Détection et dosage des aflatoxines par HPLC.…………………………………............. 94 3.15. Effet herbicide de l'aflatoxine…………………………………………………......…....... 97 Discussion ……………………………………………………………………………..…..……...... 100 Conclusion et perspectives ……………………………………………………………...……......... 106 Références bibliographiques ……………………………………………………………..……...... 109 Annexes ……………………………………………………………………….………….……....... 122 S2 Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique A.F : Aspergillus flavus INA : Institut National Agronomique A.P. : Aspergillus parasiticus MEA : Malt Extract Agar AFB1 : Aflatoxine B1 min : minute AFB2 : Aflatoxine B2 ml : millilitre AFG1 : Aflatoxine G1 µg : Microgramme (10 - 6) AFG2 : Aflatoxine G2 Nacl : Chlorure de sodium AFNOR : Association Française de Normalisation ng : nanogramme (10 – 9) AFSSA : Agence Française de sécurité sanitaire des aliments O2 : Oxygène AOAC : Association of Official Analytical Chemists OTA : Ochratoxine A ARN : Acide ribonucléique PCR : Polymerase chain reaction ATA : Aleucie Toxique Alimentaire PDA : Potato Dextrose Agar Aw : Activité de l’eau (Activity of water) Rf : Rapport frontal BGYF : Bright greenish yellow fluorescence tab : Tableau (Fluorescence jaune verdâtre) Kg : Kilogramme °C : degré Celsius TFA : Acide trifluoroacétique Cacqe : Centre Algérien du Contrôle de la Qualité et de l’Emballage UE : Union Européenne CAST : Council for Agricultural Science and Technology UV : Ultraviolet CCM : Chromatographie sur couches minces V : Volume CG : Chromatographie en phase gazeuse YES : Yeast Extract Agar cm : centimètre CNCC : Centre National de Contrôle des Céréales CPA : Acide cyclopiazonique CO 2 : Gaz carbonique CYA : Czapek Yeast Extract Agar DON : Déoxynivalénol Eliza : Enzyme – Linked immuno Sorbent Assay (Dosage immunoenzymatique en sorption) FAO : Food and Agricultural Organization of the United Nations (Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture) Fig. : Figure HACCP : Hazard Analysis Critical Control Point (Système de contrôle et d’analyse des risques des points critiques pour leur maitrise) HPLC : High performance liquid chromatography (Chromatographie liquide haute performance) INPV : Institut National de la Protection des Végétaux ITGC : Institut Technique des Grandes cultures 1 Liste des tableaux Pages Tableau 1 : Principales mycotoxines et leurs producteurs……………………………..…………..…..14 Tableau 2 : Troubles induits par les principales mycotoxines des grains………………………..….…17 Tableau 3 : Liste des lots de céréales analysés…………………………………………………..……. 25 Tableau 4 : Liste des lots des légumineuses collectés……………………………………………..……26 Tableau 5 : Viabilité des grains et taux d'humidité chez les différents lots des céréales………..……..49 Tableau 6 : Viabilité des grains et taux d'humidité chez les différents lots des légumineuses...……….50 Tableau 7 : Mycoflore pathogène chez les céréales………………………………………………….....52 Tableau 8 : Mycoflore pathogène chez les légumineuses…………………………………………..…..53 Tableau 9 : Mycoflore intermédiaire (pathogènes secondaires et saprophytes) chez les céréales……...55 Tableau10 : Mycoflore intermédiaire: (Parasites secondaires et saprophytes) chez les légumineuses..56 Tableau 11: Mycoflore du stockage chez les céréales…………………………………………….……57 Tableau 12: Mycoflore du stockage chez les légumineuses…………………………………….…….58 Tableau 13 : Recensement de la mycoflore interne chez les lots des céréales collectés……………….61 Tableau 14 : Recensement de la mycoflore interne chez les lots des légumineuses collectés………….63 Tableau 15 : Présence des agents fongiques dans toutes les parties de la graine des céréales.………..65 Tableau 16 : Présence des agents fongiques dans toutes les parties de la graine des légumineuses...….66 Tableau 17 : Description d'Aspergillus flavus selon la méthode de Pitt et Hocking…………………...70 Tableau 18 : Description d'Aspergillus parasiticus selon la méthode de Pitt et Hocking……………...71 Tableau 19 : Taux de contamination totale et de germination