Programa de Doctorado en Biotecnología Study of glycerol and respiro-fermentative metabolism diversity among Saccharomyces yeasts Bruno Motta Oliveira Tesis Doctoral, Valencia 2016 Supervisores: Dra. Amparo Querol Simón Dr. Roberto Pérez Torrado STUDY OF GLYCEROL AND RESPIRO- FERMENTATIVE METABOLISM DIVERSITY AMONG SACCHAROMYCES YEASTS Tesis doctoral presentada por: Bruno Motta Oliveira Para optar al grado de doctor en Biotecnología por la Universidad de Valencia Supervisada por: Dra. Amparo Querol Simón y Dr. Roberto Pérez Torrado La Dra. Amparo Querol Simón, Profesora de investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA), y el Dr. Roberto Pérez Torrado, investigador postdoctoral del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA). CERTIFICAN que la presente memoria “STUDY OF GLYCEROL AND RESPIRO-FERMENTATIVE METABOLISM DIVERSITY AMONG SACCHAROMYCES YEASTS” constituye la tesis doctoral de Don. Bruno Motta Oliveira para optar al grado de doctor en Biotecnología por la Universitat de València. Asimismo, certifican haber dirigido y supervisado tanto los distintos aspectos del trabajo como su redacción. Dra. Amparo Querol Simón Dr. Roberto Perez Torrado Esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la concesión de la siguiente ayuda: ►Beca de Doctorado pleno en el exterior de CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior), órgano vinculado al Ministério de Educación del gobierno de Brasil. - El trabajo aquí descrito se enmarca dentro de los Proyectos de investigación que llevan por título: 1. “Grupo biotecnología enológica: Evolución adaptativa de propiedades de interés biotecnológico en levaduras del género Saccharomyces” del Programa Prometeo para grupos de investigación de excelencia (Generalitat Valenciana). 2. “Caracterización fisiológica y enológica de nuevas cepas vínicas de levaduras no convencionales del género Saccharomyces” (AGL2009-12673-CO2- 01). 3. Análisis global de la interacción entre especies y genomas híbridos de levaduras del género Saccharomyces de interés en enología” (AGL2012- 39937-C02-01) AGRADECIMIENTOS Antes de todo agradezco a Dios por la vida y por hacerme ver su belleza en las cosas y momentos simples. Gracias por proporcionarme vivir momentos de intenso crecimiento espiritual y personal junto a los seres humanos que cito adelante. Gracias a Nossa Senhora Aparecida, por vuestra intercesión junto a Jesucristo. En el principio cuándo todo parecía imposible y distante tu acreditaste en mí y me enseñaste el camino, que sí podríamos ir todos juntos a España vivir un sueño. Así agradezco a mi esposa Aline, por el amor, incentivo y compañerismo para lograr esta victoria. A mi hijo, Leonel Lucas, sin tu presencia, pureza e inexplicable amor junto a mí a cada día pienso que todo sería mucho más difícil. Especialmente a mi familia, papalé (padre), mamãe (madre), Vinicius (hermano) y Priscilla (hermana) gracias por todo tipo de amor y apoyo que una persona puede recibir de un ser humano, fueron los principales responsables por la continuidad de mi trabajo en la tesis pasándome a cada vez que pensaba en desistir, fuerza, orientación y “cajas mágicas” (brasilidades) por correo postal a cada año, haciendo del Atlántico verdaderamente un charco. En los últimos meses, mi amada madre, Margareth, ha sido determinante para que este trabajo se finalizara, enseñándome mi valor de una manera especial. Gracias a mis primeros supervisores científicos, Aristóteles y Ana Paula por las enseñanzas y confianza depositada en mí indicándome como becario a mi tutor Carlos Rosa. Carlos, agradezco por tu confianza y orientación fundamental para lograr la beca de investigación y continuar el trabajo. Gracias, también a CAPES (órgano del Ministerio de Educación de Brasil) por la inversión y beca de estudios concedida. A Amparo Querol, por mucho más que la orientación y enseñanzas científicas, agradezco por la confianza depositada en mí y el que me haya transmitido por medio de ejemplos y actitudes efectivas toda la positividad necesaria para el desarrollo de un trabajo científico. Amparo, gracias por las orientaciones personales y por haber sido mucho más que una supervisora de tesis. Agradezco a Roberto que además de supervisar científicamente esta tesis ha estado muchas veces codo a codo conmigo en la bancada, algo fundamental a lo largo del trabajo transmitiendo seguridad y principalmente paciencia. Gracias a Eladio Barrio por el apoyo en el trabajo y charlas científicas cortas pero efectivas. Por medio de vosotros me he sentido en casa para conocer a la familia del Lab. 307, todos sus miembros intercontinentales y todo el IATA: Gracias a David Lázaro y Laura por el compañerismo y por las enseñanzas técnicas valiosas en muchos experimentos. David, gracias también por tu apoyo espiritual y Laura, por tu apoyo científico. A mis compañeros del laboratorio y IATA, no hay páginas suficientes para agradeceros en separado a cada uno por todo. Cada uno a su manera ha sido muy importante: Jiri (Zipi), Benedeta (Bene), Elisabet (Eli), David Peris, Lupita, Javi Flo, Adriana, Clara. A los que pasaron rápido mientras estuve en el lab pero de cierta forma han sido importantes para este trabajo, Jordi, Amparo Gamero, Miguel (carnal), Christian y María Eugenia, Jana (Janka), muchas gracias. También a mi paisano Gabriel recién llegado, gracias por el apoyo. Agradezco también a Bruno (Br1), Victor y Liliana (Iatamos a todos), Bea, María Malo, Rosana Chiva, Ali, Fani, Rocío, Nerea, Anto, Isaac, Lidia, Esther, Cecília, Alba, María Noel, Gabriela (paisana) y Joana, por ayuda con materiales, equipos y buenos momentos de compañía facilitando mi integración en el IATA y en la amada ciudad de Valencia. Muchas gracias al personal del IATA, principalmente, Vicky, Miguel (Barça) y Mar, Alba, Nacho, Fran, Manolo por sus charlas y conversaciones muy importantes para desconectar un poco del trabajo. Vicky gracias por toda la fuerza. A todos los del fútbol sala del IATA, Daniel, Matías, René, Ricardo, Fabio, Jimmy, El cubano… agradezco por los momentos de deporte y diversión en los cuáles también nos ayudábamos con ciencia. Gracias a los dueños de “mi piso” Antonio y Amparo por todo el cariño, receptividad, ayuda así que llegamos a Valencia para nuestra integración. Muchísimas gracias también a la familia de brasileños (Luciana, Glaucia, Ana, Maria, Angela, Yapoena, Talissa, Cris, Flávio, Dayane e Diogo) y amigos brasileños adoptivos (Lemmy, Pascal, Edu, Rafael) residentes en Valencia, por contribuir a que nuestra vida social fuese más alegre y animada. Gracias a Aneta y José que también forma parte de esta familia por el incentivo en mi último año. Especialmente, agradezco a Luís Franco por todo el apoyo espiritual, orientación para el trabajo y ánimo que fueron fundamentales para superar las dificultades enfrentadas tanto en el plan personal como en el laboral. También agradezco a querida Prof. Marta Abelda por la receptividad cuando llegamos e incentivo para la tesis, gracias a su querido hermano José conocí a Luis. A los demás jefes de investigación en el IATA, gracias por la disponibilidad en ayudar con instrucciones y orientación de todo tipo. Gracias a todos vosotros que directa o indirectamente han sido importantes para el fin de este trabajo. 'Dios nos hizo perfectos y no escoge a los capacitados, sino que capacita a los escogidos. Hacer o no hacer algo, sólo depende de nuestra voluntad y perseverancia’. (Albert Einstein) Para mis padres Leonel e Margareth y mi hijo, Leonel Lucas. INDEX I - RESUMEN AMPLIO ……….………………………………………………………………..…….………..1 II - GENERAL INTRODUCTION ………………………………………………………………….….……….15 1 THE GENUS SACCHAROMYCES YEAST………………………………………….……...17 1.1 General characteristics and life cycle…………………………………….……….17 1.2 The genus Saccharomyces: Biotechnological and alcoholic fermentation interest…………………………………………………………………….…………21 2 YEASTS AND WINEMAKING…………………............................................................... 25 3 GENETIC DIVERSITY IN Saccharomyces cerevisiae ………………… ......................... 30 4 GLYCEROL METABOLISM IN YEAST …………………................................................ 37 4.1 Glycerol and wine………………… ................................................................. 37 4.2 Overview of glycerol metabolism .................................................................. 38 4.3 Glycerol transport and osmoregulation ......................................................... 41 5 RESPIRO-FERMENTATIVE METABOLISM IN YEAST ………………………………......45 5.1 Crabtree effect and “make-accumulate-consume” life strategy……………….45 5.2 Aerobic fermentation and energy metabolism…………………………………...46 III - JUSTIFICATION & OBJECTIVES ………………...…………….…………………………….……....51 IV - MATERIAL & METHODS..…………………………………………………………………………………...57 1 Yeast strains, growth conditions and tests………………………………………….………59 1.1 Wine fermentation…………………………………………………………….…....67 1.2 Glycerol evaluation in mutants…………………………………………………...68 1.3 Osmotic and cold stress...………………………………………………………...68 1.4 Drop tests…………………………………………………………………………...69 1.5 Micro-fermentations conditions…………………………………………………...69 2 Culture media ………………………………………………………………….......................70 3 Analytical determinations ………………………………………………………….………....75 3.1 Sugars, Glycerol, Ethanol and Organic acids determinations……………....75 3.2 Intracellular glycerol determinations………………………………………………76 4 Molecular techniques ……………………………………………………………….………..77