Universidade Federal do Rio Grande do Sul Centro de Biotecnologia Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular Caracterização molecular dos componentes do veneno de Lonomia obliqua: genes expressos e princípios ativos envolvidos nos distúrbios da coagulação e da fibrinólise Ana Beatriz Gorini da Veiga Porto Alegre Outubro de 2005 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Centro de Biotecnologia Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular Caracterização molecular dos componentes do veneno de Lonomia obliqua: genes expressos e princípios ativos envolvidos nos distúrbios da coagulação e da fibrinólise Ana Beatriz Gorini da Veiga Orientador: Prof. Dr. Jorge Almeida Guimarães Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e Molecular (PPGBCM) da UFRGS como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor. Porto Alegre, Outubro de 2005 2 Banca Examinadora __________________________________________________ Dra. Helena Bonciani Nader Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo __________________________________________________ Dr. João Antônio Pêgas Henriques Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul __________________________________________________ Dr. Robson de Queiroz Monteiro Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro __________________________________________________ Dra. Célia Regina Ribeiro da Silva Carlini Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (suplente) Outubro de 2005 3 À minha mãe, Semíramis Gorini 4 Índice Agradecimentos.............................................................................................................................................6 Resumo...........................................................................................................................................................7 Abstract........................................................................................................................................................10 Apresentação ...............................................................................................................................................12 Abreviaturas................................................................................................................................................14 1. Introdução................................................................................................................................................15 1.1. A Hemostasia ...................................................................................................................................15 1.1.1. Cronologia dos Eventos ............................................................................................................18 1.1.2. Papel das Plaquetas ..................................................................................................................22 1.2. Princípios naturais que interferem na hemostasia .......................................................................24 1.2.1. A taturana Lonomia obliqua ...................................................................................................27 2. Objetivos ..................................................................................................................................................35 3. Resultados................................................................................................................................................37 3.1. Atividades paradoxais no veneno de L. obliqua: ativador de protrombina e atividade fibrin(ogen)olítica no extrato de espículas............................................................................................38 1º Artigo: Veiga, A.B.G., Pinto, A.F.M., Guimarães, J.A., 2003. Fibrinogenolytic and procoagulant activities in the hemorrhagic syndrome caused by Lonomia obliqua caterpillars. Thrombosis Research 111, 95-101. ...................................................................................................38 3.2. Genes que codificam para princípios ativos do veneno de Lonomia obliqua..............................47 2º Artigo: Veiga, A.B.G., Ribeiro, J.M.C., Guimarães, J.A., Francischetti, I.M.B., 2005. A catalog for the transcripts from the venomous structures of the caterpillar Lonomia obliqua: identification of the proteins potentially involved in the coagulation disorder and hemorrhagic syndrome. Gene 355, 11-27. .............................................................................................................47 3.3. Uma lipocalina de Lonomia obliqua participa da conversão de heme em biliverdina IXγ ........65 3º Artigo: Veiga, A.B.G., Ribeiro, J.M.C., Francischetti, I.M.B., Guimarães, J.A., Andersen, J.F., 2006. In situ conversion of heme to biliverdin IXγ by an insect bilin-binding protein (submetido)........................................................................................................................................65 5. Conclusões................................................................................................................................................81 6. Referências Bibliográficas ......................................................................................................................86 7. Perspectivas .............................................................................................................................................93 8. Co-autoria em trabalhos publicados......................................................................................................94 Ana Beatriz Gorini da Veiga - Curriculum Vitæ resumido....................................................................109 AA 5 Agradecimentos Não encontrei e jamais encontrarei palavras que descrevam suficientemente o quão grata me sinto por aqueles que colaboraram, ao longo desta etapa, para eu alcançar meus objetivos. O trabalho descrito aqui envolveu muitas pessoas que acreditaram na minha capacidade e me apoiaram nos devidos momentos. A lista abaixo é uma relação, sem ordem de preferências, de algumas dessas pessoas queridas, que tiveram sua devida participação nessa jornada. Algumas são de fato co-autores – oficiais ou não – desta Tese de Doutorado, por terem ensinado, pipetado, cedido espaço nos seus labortórios ou criticado e dado sugestões. Há, ainda, aquelas que insistiram para que eu não desistisse nos momentos mais difíceis, naqueles momentos em que nada dá certo, o experimento não funciona, surgem problemas de ordem prática, de ordem pessoal, saudades, falta de vontade… e elas estavam ali, repetindo para eu não desistir, não jogar fora o que eu já havia produzido, que meu trabalho estava dando frutos, que essas fases difíceis fazem parte… enfim, pessoas que me mostraram como é a vida de fato. A todas elas, um obrigada verdadeiro, com muito carinho e a certeza de que serão sempre lembradas. Aos meus familiares, especialmente ao meu marido, Fábio Klamt, um obrigada com amor e carinho, pelo incentivo, apoio, paciência e amor. Jorge Almeida Guimarães José Marcos C. Ribeiro Ivo M. B. Francischetti John Andersen Fábio Klamt Carlos Termignoni João A. P. Henriques Helena B. Nader Robson de Queiroz Monteiro Célia Carlini Giancarlo Pasquali Edmundo Kanan Marques Semíramis Gorini Antônio F. M. Pinto Augusto Schrank Jesus Valenzuela Israel Roisenberg Fabiana Horn Sílvia Centeno Luciano Saucedo Fernanda Mulinari Alfredo J. da Veiga-Neto Lina Zingali Maria Fátima Grossi de Sá Eduardo J. Gorini da Veiga Eric Calvo Silvio Sanches Veiga Elíbio Rech Ana Lúcia C. G. Nunes Rafael Roesler Colegas do Centro de Biotecnologia da UFRGS e do LMVR/NIAID/NIH Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular (PPGBCM) da UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul Professores do Centro de Biotecnologia da UFRGS Colegas do Laboratório de Interação Planta-Praga do Cenargen/EMBRAPA Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) 6 Resumo A hemostasia é um processo multifuncional, complexo e finamente regulado que envolve diversos componentes celulares e moleculares, incluindo plaquetas, parede vascular, cascata da coagulação sangüínea e fibrinólise. O desequilíbrio desses componentes pode desencadear condições patológicas, tais como hemorragias, hipercoagulopatias e a conseqüente trombose vascular. O descobrimento de novos princípios ativos e o desenvolvimento de drogas como instrumentos de intervenção anti- trombótica constituem estratégias de eleição para a prevenção e o tratamento do quadro trombo-embólico. Muitos desses princípios ativos são obtidos de fontes naturais, incluindo os conhecidos anti-hemostáticos presentes em venenos de serpentes e na saliva de artrópodos hematófagos. Por afetarem o sistema hemostático humano, essas moléculas são alvo de estudos para o desenvolvimento de anti-venenos, testes laboratoriais e novas drogas terapêuticas. As lagartas do gênero Lonomia são conhecidas por produzirem proteínas tóxicas que estão associadas a uma severa síndrome hemorrágica em humanos, cujo quadro clínico é caracterizado por distúrbios da coagulação, insuficiência renal aguda, hematúria, sangramentos, dentre outros sintomas. O veneno é constituído por diversos princípios ativos, incluindo atividades pró-coagulantes e fibrinolíticas. Apesar da importância social e científica desses envenenamentos e do conhecimento sobre a natureza dessas toxinas, as informações sobre as características moleculares do veneno ainda são escassas,