UNIVERSIDAD DE OVIEDO Departamento de Biología de Organismos y Sistemas. Programa de Doctorado en Biogeociencias Apogamy in the fern Dryopteris affinis ssp. affinis. Physiological and transcriptomic approach. Apogamia en el helecho Dryopteris affinis ssp. affinis. De la fisiología a la transcriptómica. TESIS DOCTORAL Alejandro Rivera Fernández Directoras: Elena Fernández González y María Jesús Cañal Villanueva Oviedo 2020 RESUMEN DEL CONTENIDO DE TESIS DOCTORAL 1.- Título de la Tesis Español/Otro Idioma: Apogamia en el helecho Inglés: Apogamy in the fern Dryopteris affinis Dryopteris affinis ssp. affinis: de la fisiología a la ssp. affinis: a physiological and transcriptomic transcriptómica approach 2.- Autor Nombre: Alejandro Rivera Fernández DNI/Pasaporte/NIE:53507888K Programa de Doctorado: BIOGEOCIENCIAS Órgano responsable: UNIVERSIDAD DE OVIEDO RESUMEN (en español) Esta memoria de tesis aborda un estudio sobre el desarrollo vegetativo y reproductivo del gametofito helecho Dryopteris affinis ssp. affinis, cuyo ciclo vital cuenta con un caso peculiar de apomixis. En concreto, se informa de un enfoque fisiológico y transcriptómico, revelando un papel de las fitohormonas, ya sea mediante el análisis de los efectos causados por la adición al medio de cultivo, o midiendo los niveles endógenos, así como a través de perfiles 010 (Reg.2018) 010 - transcriptómicos comparativos entre gametofitos unidimensionales y bidimensionales. VOA La tesis consta de cinco capítulos: una introducción, tres trabajos experimentales y una - discusión general. En la introducción, se ofrece una visión general de la investigación llevada a MAT - cabo en helechos en los últimos años, para que el lector conciba una nueva idea sobre la contribución que este grupo vegetal puede ofrecer para profundizar en la reproducción de FOR plantas, y en el concreto, en la apomixis. En cuanto a los capítulos experimentales, el primero de ellos, hace referencia a los efectos que tiene la adición al medio de cultivo del gametofito, de una selección de fitohormonas e inhibidores de biosíntesis y transporte, reflejando una modulación del desarrollo por parte de auxinas, giberelinas y poliaminas. Además, se ofrece un protocolo válido para inducir y proliferar tejido de callo. En el segundo capítulo, se analizan los niveles endógenos de auxinas, citoquinas, ácido abscísico, giberelinas, ácido salicílico y los brasinosteroides, por cromatografía líquida-espectrometría de masas de ultra-rendimiento (UHPLC), en gametofitos apogámicos en tres estados de desarrollo (filamentosos, espátulas y corazón), y en gametofitos acorazonados femeninos, de su progenitor sexual D. oreades, revelando variaciones en el contenido. Finalmente, en el tercer capítulo experimental, se generó un transcriptoma de novo y utilizando un enfoque RNA-seq, se compararon los perfiles de expresión génica de gametofitos unidimensionales y bidimensionales. Genes implicados en la regulación del desarrollo del meristemo, señalización de auxinas, reproducción y metabolismo de la sacarosa se regularon al alza en gametofitos bidimensionales, y genes implicados en respuesta a estímulo y defensa, así como en regulación epigenético y degradación de la ubiquitina, sobreexpresaban en gametofitos unidimensionales. Los resultados obtenidos proporcionan nueva información sobre la reproducción vegetativa y apogámica en el gametofito de vida libre, y representan un recurso útil para nuevas investigaciones en plantas no modelo. vi vii RESUMEN (en Inglés) This work represents a step forward to gain a better knowledge on the apogamous process in the fern Dryopteris affinis ssp. affinis, which represents a peculiar case of apomixis, in ferns. In concrete, a physiological and transcriptomic approach are reported, revealing a role of phytohormones, either by analyze the effects caused by the addition to the culture medium, or by measuring their endogenous levels, as well as through comparative transcriptomic profiles between of one- and two-dimensional gametophytes. The thesis comprises five chapters: an introduction, three experimental works, and a general discussion. In the introduction, a general view on the research driven on ferns for the last years is provided, so that the reader could conceive a new idea about the contribution this plant group might offer to deepen on plant reproduction, and in concrete on apogamy. Regarding the experimental chapters, the first one dealt with the effects caused by a wide sort of the major group of phytohormones and inhibitors of their biosynthesis and transport, reflecting a modulation of the vegetative and apogamous development by auxins, gibberellins and polyamines. Additionally, a valid protocol is available to induce proliferating callus when cultured in presence of 2,4D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), showing bodies of lipid accumulation is reported. In the second chapter, the endogenous levels of auxins, cytokinins, abscisic acid, gibberellins, salicylic acid and brassinosteroids were assessed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC) in filamentous, spatula and heart- shaped gametophytes of the apogamous fern Dryopteris affinis ssp. affinis, and in female heart-shaped gametophytes of its sexual progenitor D. oreades, revealing different profiles comparing intra an inter species. In the third experimental chapter, a gametophyte de novo transcriptome using an RNA-Seq approach was done and used to compare the gene expression profiles of one- and two-dimensional gametophytes. Genes implicated in the regulation of meristem growth, auxin signaling, reproduction, and sucrose metabolism were upregulated in two-dimensional gametophytes, and genes enriched in stimulus and defense genes as well as genes involved in epigenetic gene regulation and ubiquitin degradation, in one-dimensional gametophytes. Our results provide insights into the vegetative and apogamic reproduction in the free-living gametophyte, providing a useful resource for further investigations of asexual reproduction in non-model plants. SR. PRESIDENTE DE LA COMISIÓN ACADÉMICA DEL PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOGEOCIENCIAS_________________ vii “Es de bien nacidos, ser agradecidos.” -Refrán español- No se puede hacer nada en solitario en esta vida. Para cualquier cosa necesitamos una familia, un equipo, unos amigos, unos rivales, alguien con en quien apoyarnos, competir e incluso alguien a quien querer. Llegado a este punto tengo y sin más preámbulos. Tengo que agradecerle a mi familia, que me ha mantenido y aguantado por largos años. Sin ellos la realización de esta tesis hubiese sido imposible. Siento mucho que Nacho no esté, que Marisa no pueda, los güelos se hayan ido… pero gracias a todos los que están y los que no. A mis “jefas” que me han dado la oportunidad de hacer esta tesis, que ha tenido días buenos y malos como todas. A pesar de ello me ha permitido disfrutar y dar rienda suelta a mi creatividad. Así que me hallo agradecido ¡Gracias Helena y María Jesús! En relación con el párrafo anterior. Tengo que agradecer los congresos a los que he asistido. Han sido unas experiencias maravillosas. No es lo mismo asistir a una clase magistral que poder tomar algo con los conferenciantes. Así pues, muchas gracias a todos los profesores que me habéis enseñado algo, desde Helena a Luis, pasando por María Jesús a Prieto. Dentro del mismo área y departamento, son muchos compañeros y compañeras, Luz, Chus, Sergio, Dani, Mónica, María, Fran, Laura, Alejandro, Cristina, Rosa, Lara… chicos y chicas que han pasado a hacer sus TFG y TFM, como Sandra, Paula, Lucía, Mauro, Sara, Víctor, Ana, Sergio, Laura, Eugenio, Alejandro… siempre me habéis ayudado en el trabajo y además habéis estado ahí haciéndome compañía para que no me sintiese solo. “Gracias a Sergio Fernández Álvarez casi no acabo. “Es difícil distraerme, ¿no?” Sin ti no hubiese podido acabar. Espero que no me odies por inducirte a comprar decenas de miniaturas. También a Sergio Rodríguez Fernández el que me recordó el “hay vida más allá de la tesis” con esos numerosos bóvidos y las tierras de cultivo asociadas. Todavía nos quedan muchas cosas que hacer, tenemos que viajar juntos. viii ix Mauro Sanna, eres un tío genial siempre lo das todo y tienes una sonrisa. Hay pocas personas con tu capacidad para escuchar y dar buenos consejos, pero tú eres una de ellas. Ojalá hubiese más gente como tú. Claudia, me alegro de haber podido conocer a una persona tan inteligente y educada. Algún día, seré tan maduro como tú. Hasta entonces… te doy gracias por tu paciencia y sinceridad. Que conste que no me olvido de Carmen Blanco, ha sido un placer el conoceros a ambas. Vanessa, después de tener la constancia y la fuerza para jugar al bingo todos los días. Tienes toda mi admiración. Sin ti, Irene y Enrique, la cuarentena no hubiera sido tan divertida. También quiero recordar a Héctor González Fernández. Siempre estaba ahí sonriendo y era un gran compañero. Ojalá pudiese darle otro Morenito/Mulatito® de los que nos gustan en Fisiología Vegetal. Muchas gracias por haberme ayudado. Gracias a Paula Conde Silos por ayudarme y llevarme a parrilladas. A Lucía por ser mi referente con los libros. A Desirée por ser mi sensei de los cómics y anime. A Raúl por ser un profesional de la informática. A Ramón por llevarme a buenos restaurantes. A Sergio por mostrarme lo duro y hermoso del campo. A Nuria por la alegría. A Sergio, por los videojuegos. A Marcos Montes…por distraerme. Tengo que darle las gracias en especial, a la gente que ha pasado por el laboratorio de Bioquímica y ha escuchado toda la música que he puesto. A los dinosaurios, porque nadie se acuerda de ellos…salvo yo y Steven Spielberg (basándose en la novela de Michael Crichton). En estos años han pasado muchas cosas que no pueden resumirse en el presente libro. Me ha gustado mucho el escribir un libro, espero seguir escribiendo en un futuro mientras trabajo y me gano la vida. Me he esforzado en que sea ameno, pero siempre hay gustos y colores. Espero que el lector lo disfrute. En fin. Muchas gracias a todos. ix Abbreviations Short name Definition NPA N,1 naphtylthalamic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxiacetic acid ABA Abscisic acid AF D. affinis filamentous-shaped AH D.