UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA TESE DE DOUTORADO PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE PROTEÍNA DE FOLHAS DE Indigofera suffruticosa . Dewson Rocha Pereira Recife 2013 . Dewson Rocha Pereira PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE PROTEÍNA DE FOLHAS DE Indigofera suffruticosa . Tese apresentada para o cumprimento parcial das exigências para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima Co-Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva Recife-PE Abril – 2013 Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788 P436p Pereira, Dewson Rocha Purificação, caracterização e atividades biológicas de proteína de folhas de Indigofera suffruticosa / Dewson Rocha Pereira. – Recife: O Autor, 2013. 112 f.. : il., fig., tab. Orientador: Vera Lúcia de Menezes Lima Coorientadora: Patrícia Maria Guedes Paiva Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Pós-graduação em Bioquímica e Fisiologia, 2013. Inclui bibliografia e anexos 1. Proteínas 2. Lectinas 3. Staphylococcus aureus 4. Cândida I. Lima, Vera Lúcia de Menezes (orientadora) II. Paiva, Patrícia Maria Guedes III. Título. 572.6 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2013-234 Dewson Rocha Pereira PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE PROTEÍNA DE FOLHAS DE Indigofera suffruticosa . Tese apresentada para o cumprimento das exigências para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco. Aprovado por: ____________________________________________ Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima -Presidente ____________________________________________ Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia – UFPE ____________________________________________ Profa. Dra. Márcia Vanuza da Silva – UFPE ____________________________________________ Prof. Dr. Antônio Fernando de Melo Vaz – UFCG ____________________________________________ Prof. Dr. Roberto Araújo Sá – UFPE DATA: 29 / 04 / 2013 “O futuro tem muitos nomes. Para os fracos é o inalcansável. para os temerosos, o desconhecido. Para os valentes é a oportunidade”. Victor Hugo Aos meus pais, Ataíde Pereira e Terezinha Rocha, aos meus irmãos e familiares, pela cumplicidade e compreensão em momentos importantes. Como também a minha esposa, Anália Fernandes e ao meu filho Lucas Fernandes, pelo amor, pela confiança, pela amizade e por existirem. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus por confortar minha mente e meu corpo nos momentos importantes da minha vida. Aos meus pais Ataíde e Terezinha pela vida, pelo incentivo aos estudos, pelas lições de moral, pelo afeto, pelo amor. Aos meus irmãos Klemerson, Jobson e às minhas irmãs Érika e Mônica pelo companheirismo e apoio. A todos os meus familiares por sempre me incentivarem. A minha esposa Anália por me apoiar nas ocasiões mais decisivas da minha vida e pelo pequeno grande elo em nossas vidas, Lucas Fernandes, nosso filho. A Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima pela brilhante orientação na minha vida acadêmica e por permitir a realização desse trabalho no laboratório de Lipídios e Lipoproteínas. A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia. Ao biólogo Weber Nascimento pela amizade, cumplicidade e responsabilidade junto a este trabalho. A todos os alunos do laboratório de Lipídios pelo companheirismo. Ao nosso colaborador Albérico Leal pela ajuda científica, psicológica e espiritual, A todos os funcionários do Departamento de Bioquímica, em especial a João Virginio, Miron, Djalma, Helena e Jorge. Aos amigos, em especial Antonio Fernando, Leucio Filho, Augusto e Romero. A todos que participaram ativa ou passivamente durante este meu aprendizado. Muito Obrigado! SUMÁRIO AGRADECIMENTOS _________________________________________________ 1 LISTA DE FIGURAS __________________________________________________ 4 LISTA DE TABELAS _________________________________________________ 6 LISTA DE ABREVIATURAS ___________________________________________ 7 RESUMO ____________________________________________________________ 8 ABSTRACT _________________________________________________________ 9 INTRODUÇÃO _____________________________________________________ 10 1. PLANTAS MEDICINAIS ________________________________________ 10 2. FAMÍLIA LEGUMINOSAE ______________________________________ 11 2.1 Indigofera suffruticosa ________________________________________ 12 3. PLANTAS COMO FONTE DE BIOMOLÉCULAS __________________ 13 3.1 Lectinas ____________________________________________________ 14 3.1.1 Generalidades ____________________________________________ 14 3.1.2 Caracterização e Classificação _______________________________ 15 3.1.3 Purificação _______________________________________________ 19 3.2 Estabilidade Proteica _________________________________________ 20 3.2.1 Espectroscopia de Fluorescência ______________________________ 21 3.2.2 Termogravimetria _________________________________________ 23 3.2.3 Espectroscopia de Infravermelho _____________________________ 24 3.3 Papel Fisiológico das Lectinas _________________________________ 25 3.4 Aplicações das Lectinas _______________________________________ 25 3.4.1 Atividade Antioxidante _____________________________________ 27 3.4.2 Atividade Antibacterinana___________________________________ 28 3.4.3 Atividade Antifúngica ______________________________________ 30 OBJETIVOS ________________________________________________________ 33 1. GERAL _______________________________________________________ 33 2. ESPECÍFICOS _________________________________________________ 33 REFERÊNCIAS _____________________________________________________ 34 CAPÍTULO I _______________________________________________________ 50 CAPÍTULO II _______________________________________________________ 67 CAPÍTULO III ______________________________________________________ 82 CONCLUSÕES ______________________________________________________ 98 ANEXO ____________________________________________________________ 99 NORMAS DAS REVISTAS __________________________________________ 100 1. Archives of Biochemistry and Biophysics __________________________ 100 2. Applied Biochemistry and Biotechnology __________________________ 105 3. Applied Microbiology and Biotechnology __________________________ 107 LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO Figura 1 – Indigofera suffruticosa: ramos com folhas e inflorescência. ___________ 12 Figura 2 – Esquema ilustrativo de ensaio de hemaglutinação. __________________ 17 Figura 3 – Representação ilustrativa da estrutura de lectinas dependendo do domínio de ligação a carboidrato. __________________________________________________ 18 Figura 4 – Esquema ilustrativo de tipos de ligações químicas que podem estabilizar proteínas. ___________________________________________________________ 20 Figura 5 – Espectro de emissão de fluorescência do triptófano quando submetido a temperaturas elevadas (100 ºC). __________________________________________ 22 Figura 6 – Fluorescência da molécula bis-ANS. _____________________________ 23 Figura 7 – Parede celular bacteriana. _____________________________________ 28 CAPÍTULO I Figure 1. Isolation and partial characterization of I. suffruticosa leaf lectin.________ 64 Figure 2 . Effects of temperature and pH on HA of IsuLL._____________________ 65 Figure 3. Fluorescence emission spectra of IsuLL .__________________________65 Figure 4. Comparison DPPH radical-scavenging activity of crude aqueous extract of I. suffruticosa and of IsuLL, utilizing the quercetin as standard.___________________ 65 CAPÍTULO II Figure 1 . IsuLL FTIR (Fourier-transform infrared) analysis_____________________ 79 Figure 2. Intrinsic fluorescence emission spectra of IsuLL at different temperatures._79 Figure 3 . Extrinsic fluorescence emission spectra of IsuLL at different temperatures._______________________________________________________80 Figure 4. Typical Thermogravimetric Analysis (TGA) diagram of IsuLL. _________80 CAPÍTULO III Figure 1. Crystal violet uptake of IsuLL treated Staphylococcus aureus (strain 27).__ 95 Figure 2. Measuring absorbance of the cell materials contents at 260nm releasing.__ 95 Figure 3. Electron micrographs of S. aureus (strain 27) cells after treatment with IsuLL.___________________________________________________________ 96 LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO Tabela 1 – Relação tipo de estrutura secundária e região do espectro de absorção infravermelho._________________________________________________________ 25 CAPÍTULO I Table 1. Stages of purification process from aqueous extract of I. suffruticosa .______ 64 Table 2. Inhibition test of IsuLL with carbohydrate and glycoproteins.____________ 65 Table 3. Antibacterial activity of IsuLL.____________________________________66 CAPÍTULO II Table 1. Temperature range and weight loss under nitrogen atmosphere.___________80 Table 2. Antifungal activity of IsuLL.______________________________________81 CAPÍTULO III Table 1. Antistaphylococcal activity of IsuLL.______________________________ 95 Table 2. Effect of IsuLL on the Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) of ampicillin (AMP), cifoxitin (CF) and ciprofloxacin (CP) against S. aureus ______ ___ 97 Table 3. Fractional inhibitory concentration index (FICI) values of cifoxitin (CF), ampicilin (AMP) and ciprofloxacin (CP) with IsuLL against S. aureus.____________97 LISTA DE ABREVIATURAS Bis-ANS – 4,4’-dianilino-1,1’-binaftil-5,5’-sulfonato