UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL Centro de Biotecnologia Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular Urease de Canavalia ensiformis e peptideos derivados: Interação com a membrana lipídica e a formação de canais iônicos Angela Regina Piovesan Tese submetida ao Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Orientação: Profa. Dra. Célia Regina Ribeiro da Silva Carlini Prof. Dr. Jean-Louis Schwartz Porto Alegre, setembro de 2013 ii Membros da Banca Examinadora Dr. Luiz Anastácio Alves Pesquisador Titular da Fundação Oswaldo Cruz e Prof. Dr. Guido Lenz Departamento de Biofísica e Centro de Biotecnologia, UFRGS Dr. Fabricio Simão Pesquisador do Instituto do Cérebro, PUCRS Revisor: Dr. Cháriston André Dal Belo Universidade Federal do Pampa, UNIPAMPA iii Agradecimentos Agradeço especialalmente à Célia, por ter me dado a oportunidade de começar como aluna de IC no Laprotox. Ao meu orientador Jean-Louis Schwartz, pela pela paciência e dedicação em me ensinar o ABC sobre eletrofisiologia. Aos membros da banca por terem aceitado a contribuir com o aprimoramento deste trabalho. À querida Angela, minha colega desde o início da Biologia e que até hoje é minha super parceira e amiga. À Marina, minha colega também desde o tempo da graduação e que me fez companhia aqui e lá no Canadá. Foram muitas visitas Toronto ↔ Montréal!! À Fernanda, que foi com quem eu começei a trabalhar dentro do laboratório e me incentivou a viajar logo no início do Mestrado. Aprendi muito com ela e até hoje é meu exemplo de profissional. À Anne, que por muitas e muitas tardes ficou esperando comigo os “channels” aparecerem! Agradeço à todos os outros colegas laprotoxianos pelo aprendizado e companhia ao longo desses 9 anos de convívio. Karine, Val, Vanessa e Rodrigo obrigada pela amizade! Aos amigos de Montréal: Helaine, Maysam e Sebástien. Ao Marc Juteau, pelo suporte nos experimentos iniciais. À Hélène e Mouzi pelo ótimo convívio de meses!! Ao Tinoko pela disposição em ajudar sempre que preciso. À Silvia e Luciano por sempre resolverem prontamente os problemas burocráticos. Ao Matheus, que me ajudou a manter o equilíbrio nos momentos difíceis. Sem tua companhia as coisas seriam sempre mais difíceis. À minha família, é indescritível saber que posso contar com ela sempre, pra qualquer coisa. Especialmente ao meu pai e minha mãe. Às agências de fomento do Brasil e Canadá, sem elas nada disso teria sido feito. iv A primeira parte do trabalho foi realizada no Laboratório de Proteínas Tóxicas (Laprotox), do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sob orientação da Profa. Dra. Célia Regina Ribeiro da Silva Carlini, com financiamento das agências CAPES, CNPq e FAPERGS. A segunda parte deste trabalho foi desenvolvida no Laboratório do Prof. Dr. Jean-Louis Schwartz, membro do Centre SÈVE e Groupe d’Étude des Protéines Membranaires, Departamento de Fisiologia, na Université de Montréal – Canadá, em duas etapas de 6 meses cada, através do Programa de Intercâmbio para alunos estrangeiros financiado pelo “Fonds de recherche du Québec – Nature et Technologies (FQRNT)“ v Índice Resumo ............................................................................................................... viii Abstract ............................................................................................................... ix Lista de abreviaturas ........................................................................................... x 1. Introdução ..................................................................................................... 1 1.1. Ureases ............................................................................................ 1 1.2. Efeito inseticida .............................................................................. 5 1.3. Interação com membrana ................................................................. 8 1.4. Proteínas formadoras de poro (PFP) ................................................ 10 1.5. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) .................................................12 1.6. Eletrofisiologia ................................................................................13 Objetivo geral ..................................................................................................... 16 Organização da tese ............................................................................................ 17 Capítulo I ........................................................................................................... 18 2. Objetivo .......................................................................................................... 19 2.1. Objetivos específicos ....................................................................... 19 3. Metodologias .................................................................................................. 20 3.1. Expressão e purificação dos peptídeos recombinantes de Jbtx ....... 20 3.2. Ensaio de extravasamento de lipossomos ........................................ 20 4. Resultados ..................................................................................................... 23 4.1. Permeabilização de lipossomos causada por Jbtx ........................... 23 4.2. Permeabilização de lipossomos causada por JBU ........................... 26 Capítulo II (manuscrito) ................................................................................... 29 1. Introduction .............................................................................................. 33 2. Materials and Methods ............................................................................. 35 2.1. Chemicals ..................................................................................... 35 2.2. Expression and purification of Jbtx and derived mutants ............ 36 2.3. Planar lipid bilayers ...................................................................... 36 2.4. Electrophysiological assays ......................................................... 37 2.5. Data recording and analysis ......................................................... 37 3. Results ...................................................................................................... 39 3.1. Channel properties of JBU ........................................................... 40 vi 3.2. Channel properties of Jbtx ........................................................... 42 3.3. Channel properties of Jbtx N-ter .................................................. 45 3.4. Channel properties of Jbtx C-ter .................................................. 47 3.5. Channel properties of Jbtx ∆-β ..................................................... 49 4. Discussion ................................................................................................ 51 Discussão Geral .................................................................................................. 64 Conclusões .......................................................................................................... 67 Bibliografia ......................................................................................................... 69 Anexos .............................................................................................................. 79 1. Manuscrito: “Structure-function studies on Jaburetox, a recombinant insecticidal and antifungal peptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease” ................................................................................... 80 2. Resultados preliminares ........................................................................... 91 3. Currículo Lattes ........................................................................................ 95 vii Resumo Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx ∆-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível