Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 182-192 Phân loại và quan hệ di truyền của giống Thằn lằn ngón Cyrtodactylus (Squamata: Gekkonidae) ở Việt Nam Ngô Thị Hạnh1,*, Lê Đức Minh2,3, Phạm Duy Nghĩa2, Nguyễn Thị Hồng Vân1, Phạm Thế Cường4, Nguyễn Quảng Trường4 1Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam 2Khoa Môi Trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam 3Viện Nghiên cứu Tài nguyên và Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội, 19 Lê Thánh Tông, Hà Nội, Việt Nam 4Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng 8 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 09 tháng 9 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Cyrtodactylus là một trong những nhóm có mức độ đa dạng cao nhất trong họ tắc kè (Gekkonidae) ở Việt Nam. Năm 1997 chỉ có ba loài được ghi nhận phân bố ở Việt Nam, và cho tới nay 38 loài đã được mô tả và ghi nhận. Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số loài có hình thái rất giống nhau dẫn tới việc phân loại các loài thằn lằn ngón đến nay vẫn chưa rõ ràng. Dựa trên các mẫu thu từ 24 tỉnh trên cả nước, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu toàn diện về mối quan hệ di truyền cho tất cả các loài đã được mô tả ở Việt Nam dựa trên trình tự của một phân đoạn gen COI. Kết quả cho thấy loài C. paradoxus là loài đồng danh của loài C. condorensis và loài C. thuongae là loài đồng danh của C. dati. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy các loài thuộc giống Cyrtodactylus ở Việt Nam tập hợp thành 4 nhóm: nhóm A gồm các loài C. hontreensis, C. intermedius, C. cf. phuquocensis; nhóm B gồm các loài C. badenensis, C. bidoupimontis, C. bugiamapensis, C. caovansungi, C. cattienensis, C. cryptus, C. cucdongensis, C. dati, C. eisemanni, C. grismer, C. huynhi, C. irregularis, C. kingsadai, C. leegrismer, C. paradoxus, C. phuocbinhensis, C. pseudoquadrivirgatus, C. takouensis, C. taynguyenensis, C. yangbayensis and C. ziegleri; nhóm C gồm các loài C. phongnhakebangensis, C. roesleri; các loài còn lại thuộc nhóm D. Từ khóa: Cyrtodactylus, loài đồng danh, quan hệ phát sinh loài. 1. Giới thiệu được ghi nhận (Uetz và Hošek 2017). Các loài của giống này có vùng phân bố rộng kéo dài từ Cyrtodactylus là một trong những giống có vùng nhiệt đới Nam Á, Đông Nam Á, mức độ đa dạng thành phần loài cao nhất trong Phi-lip-pine, quần đảo Indo-Australia tới phía họ tắc kè (Gekkonidae) với hơn 200 loài đã Đông đảo Solomon (Bauer và Henle 1994; _______ Nguyễn và cộng sự 2010, 2015; Lưu và cộng * Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-1648631354. sự 2014). Trong mười năm trở lại đây, có tới Email: [email protected] 135 loài mới được phát hiện trên thế giới và https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4530 Việt Nam được coi là một trong những trung 182 N.T. Hạnh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 182-192 183 tâm có nhiều loài mới được khám phá nhất trình tự, từ đó xây dựng cây phát sinh loài. Đây (Uetz và Hošek 2017). Năm 1997 chỉ có ba là chỉ thị phân tử đã được sử dụng thành công loài được ghi nhận phân bố ở Việt Nam, từ đó trong nhiều công trình nghiên cứu trước đây cho tới nay có 35 loài mới thuộc giống (Nguyễn Ngọc Sang và cộng sự 2014, Cyrtodactylus được mô tả với bộ mẫu chuẩn Schneider và cộng sự 2014, Nguyễn Quảng thu được tại Việt Nam nâng tổng số loài lên 38 Trường và cộng sự 2015, Lưu Quang Vinh và (Ziegler và cộng sự 2013, Nguyễn Ngọc Sang cộng sự 2016). Cặp mồi để khuếch đại đoạn và cộng sự 2014, Phùng Mỹ Trung và cộng sự gen COI có trình tự như sau: VF1d: 2014, Nguyễn Quảng Trường và cộng sự 2015, 5’TTCTCAACCAACCACAARGAYATYGG Lê Trung Dũng và cộng sự 2016). Các loài -3’), VR1d (5’- thằn lằn ngón rất giống nhau về mặt hình thái TAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA- nhưng lại có sự phân tách khá rõ ràng về mặt 3’) (Ivanova và cộng sự 2006). di truyền (Grismer và cộng sự 2015) gây ra Các mẫu được tách chiết sử dụng bộ Kit những khó khăn trong việc phân loại. Do đó, Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, CHLB thằn lằn ngón đã được coi là đối tượng lí tưởng Đức) và GeneJet Genomic DNA Purification cho các nghiên cứu về phân loại học kết hợp (ThermoFisher). Quá trình tách chiết được tiến giữa chỉ thị di truyền và hình thái. Hơn nữa, hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản mặc dù một số nghiên cứu về mối quan hệ phát ứng PCR được tiến hành với HotStarTaq sinh loài của các thành viên thuộc giống Mastermix (Qiagen, CHLB Đức) với những Cyrtodactylus ở Việt Nam đã được thực hiện mẫu thu từ lâu và bảo quản trong điều kiện nhưng chưa có nghiên cứu nào phân tích toàn nhiệt độ và dung dịch không đảm bảo (mẫu có bộ các loài đã mô tả tại Việt Nam. Vì vậy, nồng độ ADN thấp) và DreamTaq Mastermix trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành (ThermoFisher) với những mẫu mới có chất phân tích quan hệ phát sinh loài của các loài đã lượng tốt (mẫu có nồng độ ADN cao). Tổng được mô tả của giống Cyrtodactylus cùng với thể tích của mỗi phản ứng PCR là 21µl, bao các mẫu vật thu thập từ các quần thể mới được gồm 1-2µl ADN khuôn (tùy theo nồng độ ghi nhận bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử ADN tổng số), 2µl mỗi mồi (10µl/µl), 5µl ADN là một đoạn gen COI thuộc hệ gen ty thể. nước, 10µl mastermix. Chu trình nhiệt của Kết quả nghiên cứu không chỉ làm sáng tỏ những phản ứng PCR là 95oC ở 15’ đối với vấn đề còn tồn tại về phân loại mà còn đóng góp Mastermix của Quiagen và 5’ đối với các thông tin hữu ích về mối quan hệ di truyền Mastermix của Thermo; 35 chu kỳ phản ứng ở của các loài thằn lằn ngón tại Việt Nam. 95oC trong 30’’, 48oC trong 45’’, 72oC trong 1’; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 6’. 2. Vật liệu và phương pháp Đối chứng âm được tiến hành song song trong mỗi lần tách chiết cũng như từng phản ứng PCR. 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, 2pg/ml ethidium- Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bromide, trong đệm TBE 1X (Tris base, boric 54 mẫu vật thu ở các vùng địa lý khác nhau từ acid, EDTA pH8) ở 90V trong 30 phút. Sau đó 24 tỉnh thành trong cả nước (Hình 1). Các loại được hiển thị bằng tia cực tím trên máy mẫu vật gồm: mẫu mô cơ, gan và mô đuôi của Alphalmager MINI (Protein Simple, Mỹ). các loài Thằn lằn ngón được giữ riêng trong Các sản phẩm PCR thành công sau đó cồn 70% và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Thông được tinh sạch bằng sử dụng kit GeneJet tin chi tiết về các mẫu được thể hiện trong PCR Purification (Thermo Fisher Scientific) bảng 1. và gửi giải trình tự hai chiều tại công ty Đoạn gen Cytochrome c oxidase subunit I FirstBase (Malaysia). Kết quả giải trình tự (COI) được lựa chọn để khuếch đại và giải được xác thực bằng công cụ BLAST (NCBI) 184 N.T. Hạnh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 182-192 trước khi tiến hành các phân tích tiếp theo về 1000 thế hệ. Cyrtodactylus elok được lựa chọn cây quan hệ di truyền. là nhóm ngoài. Giá trị của gốc nhánh được coi là đáng tin cậy khi xác suất hậu nghiệm (PP) ≥ 2.2. Xây dựng cây quan hệ di truyền 95%. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu được xác định bằng phần mềm PAUP v4.0b10 Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng (Swofford 2001). phần mềm Sequencher v4.1.4 (Gene Codes Corp, AnnArbor, MI, USA). Sau đó, các trình tự đã giải mã cùng với các trình tự từ Ngân hàng Gen (Genbank) được gióng cột bằng phần mềm ClustalX (Thompson và cộng sự 1997) với các lựa chọn mặc định cho chức năng sắp xếp hoàn chỉnh. Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên phương pháp Bayesian sử dụng phần mềm MrBayes v3.2 (Ronquist và cộng sự 2012). Mô hình tiến hóa tối ưu được xác định bằng phần mềm Modeltest v3.7 (Posada và Crandal 1998) với các thông số khác được phần mềm MrBayes xác định.