INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE Penicillium spp. MEDIANTE EXTRACTOS VEGETALES E HIDROTERMÍA EN CORMOS DE GLADIOLO DURANTE EL ALMACENAMIENTO TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES PRESENTA ARELI MITSHU HERNÁNDEZ MORENO YAUTEPEC, MORELOS, NOVIEMBRE DE 2013 El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Departamento de Interacción Planta Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Laura Leticia Barrera Necha. Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico de CONACyT (416914) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (20113542, 20120432, 20131761). AGRADECIMIENTOS Agradezco al CeProBi y a sus integrantes que permitieron la realización de este trabajo de tesis y participaron de manera directa e indirecta en mi formación académica; primordialmente agradezco a la Dra. Laura Leticia Barrera Necha por su guía y apoyo. También quiero agradecer puntualmente a quienes colaboraron en la mejora constante de este trabajo con sus aportaciones, observaciones y correcciones: Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez, M.C. Mónica Hernández López, Dra. Elsa Ventura Zapata, Dr. Federico Castrejón Ayala, a mi asesor externo Dr. Ramón Villanueva Arce y de manera especial a la Dra. Silvia Bautista Baños. Agradezco a la Dra. Guadalupe Espín por las facilidades y el apoyo brindado al trabajar en su laboratorio, ubicado en el Instituto de Biotecnología Molecular de la UNAM, y al Dr. Renato León Rodríguez por el asesoramiento en parte importante del trabajo. Agradezco finalmente a todos los administrativos del CeProBi que estuvieron apoyándome en la realización de todos los trámites necesarios para llegar a este momento, en especial a la Lic. Elvia Sosa López. A mi mamá y hermano CONTENIDO ÍNDICE DE CUADROS IV ÍNDICE DE FIGURAS VI RESUMEN IX ABSTRACT X 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3 2.1. Cultivo e importancia económica del gladiolo 3 2.2. Multiplicación del gladiolo 4 2.2.1. Morfología del cormo 4 2.3. Manejo Postcosecha 6 2.3.1. Colecta de cormos 6 2.3.2. Almacenamiento de cormos 7 2.3.3. Almacenamiento de cormos en Morelos 8 2.4. Pudrición del cormo de gladiolo 8 2.4.1. Fitopatógenos reportados en México 9 2.5. Morfología y taxonomía de Penicillium 11 2.6. Pudrición de almacén causada por Penicillium gladioli McCulloch 14 y Thom 2.7. Manejo de la pudrición de almacén 16 2.7.1. Labores culturales 16 2.7.2. Control químico 17 2.7.3. Tratamientos hidrotérmicos 17 2.7.4. Control biológico 18 2.7.5. Productos naturales 19 I 2.7.6. Tratamientos integrados 20 3. OBJETIVOS 22 3.1. Objetivo general 22 3.2. Objetivos específicos 22 4. MATERIALES Y MÉTODOS 23 4.1. Aislamiento y purificación de especies de Penicillium 24 4.1.1. Pruebas de patogenicidad de aislados de Penicillium 24 4.1.2. Identificación molecular de aislados de Penicillium 25 4.1.2.1. Extracción de ADN 25 4.1.2.2. Análisis molecular 26 4.1.3. Comportamiento cultural y micromorfología de aislados de 27 Penicillium 4.2. Obtención de extractos botánicos 28 4.2.1. Colecta de material vegetal 28 4.2.2. Preparación de extractos vegetales 29 4.2.3. Cormos de gladiolo 29 4.3. Evaluación In vivo de tratamientos para el manejo preventivo y 31 curativo de la pudrición del cormo en almacén 4.3.1. Extractos hexánico de epazote y metanólico de guayaba 31 4.3.2. Tratamientos hidrotérmicos 32 4.3.3. Tratamientos integrados a dos temperaturas de 32 almacenamiento 4.4. Análisis estadístico 33 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35 5.1. Aislamientos de Penicillium 35 5.1.1. Pruebas de patogenicidad de los aislados de Penicillium 35 II 5.1.2. Identificación molecular de aislados de Penicillium 39 5.1.3. Comportamiento cultural y micromorfología de aislados 40 de Penicillium 5.2. Evaluación In vivo de extracto hexánico de epazote y extracto 51 metanólico de guayaba para el manejo curativo y preventivo de la pudrición del cormo en almacén 5.3. Evaluación In vivo de tratamientos hidrotérmicos para el manejo 59 curativo y preventivo de la pudrición del cormo en almacén 5.4. Ensayo integrado para el manejo curativo y preventivo de la 67 pudrición del cormo en almacén 6. CONCLUSIONES 79 7. PERSPECTIVAS 81 8. LETERATURA CITADA 82 III ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Agentes causales de la pudrición de cormo de gladiolo 9 reportados en México. Cuadro 2. Clasificación taxonómica del género Penicillium spp. (Crous et 13 al. 2004). Cuadro 3. Comportamiento cultural de Penicillium gladioli McCulloch y 15 Thom; 7d 25 °C en medio Czapek – levadura autolizada – agar (CYA) (McCulloch y Thom 1928, Frisvad y Samson 2004). Cuadro 4. Micromorfología de Penicillium gladioli McCulloch y Thom; 7d 25 15 °C en medio Czapek – levadura autolizada – agar (CYA). (McCulloch y Thom 1928, Frisvad y Samson 2004). Cuadro 5. Reacción de amplificación del PCR en 30 ciclos. 27 Cuadro 6. Escala de grado visual para el daño de Penicillium en cormos de 30 gladiolo. Cuadro 7. Infección de cormos de gladiolo var. Grand Prix ® calibre 10/12 36 inoculados con suspensión de esporas de cuatro aislados de Penicillium. Cuadro 8. Infección de cormos de gladiolo var. Grand Prix ® calibre 10/12 36 inoculados con micelio de cuatro aislados de Penicillium. Cuadro 9. Identificación molecular de aislados de Penicillium en cormos de 40 gladiolo var. Grand Prix ® calibre 10/12. Cuadro 10. Comparación del comportamiento cultural y micromorfología de 42 aislados de Penicillium en cormos de gladiolo var. Grand Prix ® en almacén con la especie P. verrucosum Dierckx (KC009832). Cuadro 11. Comparación del comportamiento cultural y micromorfología de 45 aislados de Penicillium en cormos de gladiolo var. Grand Prix ® en su tiempo de almacén con la especie P. rugulosum Thom (GU566230.1). Cuadro 12. Viabilidad de cormos de gladiolo a dos y cuatro meses de aplicar 58 los tratamientos con extractos hexánico de epazote y metanólico de guayaba. Valores expresados en días de emergencia y porcentaje de germinación. IV Cuadro 13. Viabilidad de cormos de gladiolo a dos y cuatro meses de aplicar 63 los tratamientos hidrotérmicos. Valores expresados en días de emergencia y porcentaje de germinación. Cuadro 14. Resultado de la prueba ANOVA de dos vías obtenida de las 68 interacciones de Temperatura de almacén y Tratamiento en el control de la pudrición del cormo de gladiolo ocasionada por Penicillium spp. Cuadro 15. Viabilidad de cormos de gladiolo a dos y cuatro meses de aplicar 70 el tratamiento integrado curativo. Valores expresados en días de emergencia y porcentaje de germinación. Cuadro 16. Resultado de la prueba de ANOVA de dos vías obtenida de las 72 interacciones de Temperatura de almacén y Tratamiento en el control de la pudrición del cormo de gladiolo ocasionada por Penicillium spp. Cuadro 17. Viabilidad de cormos de gladiolo a dos y cuatro meses de aplicar 74 los tratamientos preventivos individuales y el combinado. Valores expresados en días de emergencia y porcentaje de germinación. V ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Cormo de gladiolo. A) apariencia externa, B) sección 5 longitudinal mostrando la estructura sólida del tallo comprimido (Chahín et al. 2007). Figura 2. Cosecha de cormos de gladiolo (Buschman 1984). 6 Figura 3. Multiplicación de cormos de gladiolo después del ciclo de 7 cultivo (López 1989). Figura 4. Estructura morfológica y tipos de ramificación de conidióforos 12 en Penicillium. (a) monoverticillate; (b) monoverticillate con métulas; (c) biverticillate; (d) terverticillate (Samson et al. 1984). Figura 5. Daño externo en cormos de gladiolo por Penicillium. 14 Figura 6. Daño interno en cormos de gladiolo por Penicillium. 14 Figura 7. Síntomas de infección en cormos de gladiolo var. Grand Prix® 37 calibre 10/12 inoculados con suspensión de esporas de P. verrucosum Dierckx (1P, 2P y 4P) y P. rugulosum Thom (3P). Se observa en el aislado más agresivos (1P): necrosis de raíces, hundimientos de coloración café y presencia de micelio. El daño interno se manifiesta por coloración roja, comparada con testigo. Figura 8. Síntomas de infección en cormos de gladiola var. Grand Prix® 38 calibre 10/12 inoculados con micelio de P. verrucosum Dierckx (1P, 2P y 4P) y P. rugulosum Thom (3P). Se observan hundimientos de coloración café y presencia de micelio. El daño interno se manifiesta por decoloración del tejido. Figura 9. Colonias de P. verrucosum Dierckx (1P) 7 d, 25°C en (A) PDA, 47 (B) Cz’ y (C) MEA. (D) Conidióforos y conidias. Figura 10. Colonias del aislado de P. verrucosum Dierckx (2P) 7 d, 25°C 48 en (A) PDA, (B) Cz’ y (C) MEA. (D) Conidióforos y conidias. Figura 11. Colonias del aislado de P. verrucosum Dierckx (4P) 7 d, 25°C 49 en (A) PDA, (B) Cz’ y (C) MEA. (D) Conidióforos y conidias. Figura 12. Colonias de P. rugulosum Thom (3P) 7 d, 25°C en (A) PDA, 50 (B) Cz’ y (C) MEA. (D) Conidióforos y conidias. Figura 13. Reducción de daño de Penicillium en cormos de gladiolo 51 después de aplicar los tratamientos curativos con extracto VI hexánico de epazote 0.1 % (HE1), 0.25 % (HE2), 0.5 % (HE3); extracto metanólico de guayaba al 1 % (MG1), 2.5 % (MG2), 5.0 % (MG3); tratamientos testigo procloraz y agua. Valores con la misma letra muestran igualdad estadística. H=54.940, 7 gl y P≤0.05, Tukey (P≤0.05). Figura 14. Daño en cormos de gladiolo después de aplicar los 52 tratamientos preventivos con extracto hexánico de epazote 0.1 % (HE1), 0.25 % (HE2), 0.5 % (HE3); extracto metanólico de guayaba al 1 % (MG1), 2.5 % (MG2), 5.0 % (MG3); tratamiento testigo procloraz y agua.