UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DEL POLEN DE PLANTAS CULTIVADAS FACTORES CLAVE IMPLICADOS EN LA EMBRIOGÉNESIS DE MICROSPORAS INDUCIDA POR ESTRÉS EN CEBADA Y COLZA: METILACIÓN DEL DNA, PROTEÍNAS DE ARABINOGALACTANOS Y AUXINA TESIS DOCTORAL AHMED ABDALLA ELTANTAWY MADRID, 2016 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DEL POLEN DE PLANTAS CULTIVADAS KEY FACTORS INVOLVED IN STRESS-INDUCED MICROSPORE EMBRYOGENESIS IN BARLEY AND RAPESEED: DNA METHYLATION, ARABINOGALACTAN PROTEINS AND AUXIN Ph.D. thesis AHMED ABDALLA ELTANTAWY MADRID, 2016 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA FACTORES CLAVE IMPLICADOS EN LA EMBRIOGÉNESIS DE MICROSPORAS INDUCIDA POR ESTRÉS EN CEBADA Y COLZA: METILACIÓN DEL DNA, PROTEÍNAS DE ARABINOGALACTANOS Y AUXINA MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR: AHMED ABDALLA ELTANTAWY VºBº DIRECTORES DE TESIS Fdo. Dra. Pilar S. Testillano Fdo. Dra. M.C. Risueño Almeida Fdo. Ahmed Abdalla ElTantawy MADRID, 2016 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DEL POLEN DE PLANTAS CULTIVADAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS DÑA. PILAR SÁNCHEZ TESTILLANO Y DÑA. MARIA DEL CARMEN RISUEÑO ALMEIDA , INVESTIGADORES DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS EN EL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS DE MADRID CERTIFICAN: QUE LA TESIS DOCTORAL TITULADA: “FACTORES CLAVE IMPLICADOS EN LA EMBRIOGÉNESIS DE MICROSPORAS INDUCIDA POR ESTRÉS EN CEBADA Y COLZA: METILACIÓN DEL DNA, PROTEÍNAS DE ARABINOGALACTANOS Y AUXINA” , REALIZADA POR EL LICENCIADO EN BIOLOGÍA AHMED ABDALLA ELTANTAWY , EN EL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC) BAJO SU DIRECCIÓN REÚNE LAS CONDICIONES EXIGIDAS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN BIOLOGÍA EN MADRID, 2016 FDO. DRA. PILAR SÁNCHEZ TESTILLANO FDO. DRA. M. CARMEN RISUEÑO ALMEIDA El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral ha sido realizado en el grupo de investigación de BIOTECNOLOGÍA DEL POLEN DE PLANTAS CULTIVADAS del CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS de Madrid, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, con ayuda de una beca del PROGRAMA JAE PREDOCTORAL DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (JAEPre 2010-052) La investigación ha sido realizada en el marco de los siguientes proyectos: -Proyectos del Plan Nacional: BFU2008-00203 BFU2011-23752 AGL2014 – 52028-R -Proyecto de cooperación internacional: Acción integrada Hispano-Portuguesa PRI-AIBPT-2011-0763 Figure 5: Rapeseed plant Brassica napus INDEX RESUMEN/ ABST RACT ………………………………………………........ 1 RESUMEN ………………………...…………………………………….. 3 ABSTRACT ……………………………………………………………… 9 GENERAL INTRODUCTION ………………………………………………. 15 1. SEXUAL REPRODUCTION IN ANGIOSPERMS …………………. 17 . 1. a. Alternation of generations ……… …………………………….… 17 1. b. Microsporogenesis and microgametogenesis in Angiosperms ... .. 18 1. c. Megasporogenesis and megagametogenesis in Angiosperms ….. 21 1. d. Double fertilization in Angiosperms …………… .. ……...……… 22 2. ZYGOTIC EMBRYOGENESIS ……………………………………... 24 2. a. Develop ment of dicotyledonous embryo … …………………… 25 2. b. Development of mono cotyledonous embryo ………………….... 27 2. c. Factors involv ed in embryogenesis …………………………… 29 3. ZYGOTIC EMBRYOGENESIS VERSUS SOM ATIC EMBRYOGENESIS …………………………………………………. 30 4. MICROSPO RE EMBRYOGENESIS ……………………………….. 32 4. a. The developmental pathway of microspore embryogenesis …... 34 4. b. Factors affectin g microspore culture ………………………… 35 4. c. The application of microspore embryogenesis in plant breeding 37 5. PLANT SYSTEMS TO STUDY MICROSPORE EMBRYOGENESIS …………………………………………………. 38 5. a. Rapeseed ( Brassica napus L.) ……………………………….. 38 5. b. Barley ( Hordeum vulgare L.) ……………………………… 42 6. EPIGENETIC MODIFICATIONS ………………………………….. 45 6. a. DNA methylation ………………………………...…………….. 47 7. ARABINOGAL ACTAN PROTEINS (AGPs) ……………………… 49 7. a. The structure of AGPs …… …... ….. ……………………………. 50 7. b. AGPs during pollen developm ent and microspore embryogenesis 52 8. AUXINS ………………………………………………………….… 55 OBJECTIVES ………………………………………………………………... 61 RESULTS ……………………………………………………………………. 67 PUBLICATION I: Changes in DNA methylation levels and nuclear distribution patterns after microspore reprogramming to embryogenesis in barl ey ………………………………………………………………………… 69 ABSTRACT ………………………………………………….……… 71 INTRODUCTION …………………………………………………... 72 MATERIAL AND METHODS …………………………………….. 74 RESULTS ………………………………………………………..….. 75 DISCUSSION ……………………………………………………….. 82 PUBLICATION II: 5 -azacytidine promotes microspore embryogenesis initiation by decreasing global DNA methylation, but prevents subsequent embryo development in rapeseed and barley ………………………… ……. 89 ABSTRACT …………………………………………………………. 91 INTRODUCTION …………………………………………………... 92 MATERIAL AND METHODS ……………………………………... 94 RESULTS ………………..………………………………………….. 100 DISCUSSION ………………………...……………………………... 115 PUBLICATION III: Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis ad pollen development in Brassica napus ………………………………………………………………. 125 ABSTRACT …………………………………………………………. 127 INTRODUCTION …………………………………………………... 128 MATERIAL AND METHODS ……………………………………... 130 RESULTS …………………………………..……………………….. 133 DISCUSSION …………...…………………………………………... 145 ANNEX 1 to publication III: AGPs are induced after microspore embryogenesis initiat ion in barley ………………………………………….. 151 ANNEX 2 to publication III: The blocking of AGPs by Glucosyl -Yariv reagent impairs microspore embryogenesis initiation and progression in rapeseed and barley …………………………………………………………... 157 PUBLICATION IV: Auxin increase and distribution, and effects of auxin inhibitors on microspore embryogenesis initiati on and progression in barley . 167 ABSTRACT …………………………………………………….…… 169 INTRODUCTION …………………………………………………... 170 MATERIAL AND METHODS ………………………………….….. 17 3 RESULTS ………………………………………………………..….. 177 DISCUSSION ……………………………………………………….. 187 GENERAL DISCUSSION …………………………………………………... 193 1. SIMILAR KEY FACTORS ARE INVOLVED IN MICROSPORE EMBRYOGENESIS OF MONOCOT AND DICOT SPECIES AND REVEAL GEN ERAL REGULATORY MECHANISMS … .. ……… 19 5 2. DYNAMICS OF GLOBAL DNA METHYLATION LEVEL AND DISTRIBUTION DURING MICROSPORE EMBRYOGENESIS …. 196 2. a. The patterns of DNA methylation change during pollen development and microspore embryogenesis ………….…….. 197 2. b. The DNA demethylating agent AzaC favours microspore emb ryogenesis initiation ………………………... …………….. 201 2. c. Microspore -derived embryo differentiation involves DNA hypermethylation ……………………………………………….. 20 3 3. ARABINOGALACTAN PROTEINS (AGPs) ARE INDUCED AFTER MICROSPORE EMBRYOGENESIS INITIATION ……….. 20 5 3. a. AGPs show different patterns dur ing microspore embryogenesis and pollen development …… …… .. ……………………………. 20 5 3. b. The blocking of AGPs by Yariv reagent impairs microspore embryogenesis initiation ……………………………………….. 209 4. AUXIN IS INVOLVED IN MICROSPORE EMBRYOGENESIS INITIATION AND PROGRESSION ………………………………... 21 1 4. a. Endogenous auxin increases and is accumulated in early microspore embryo cells ………… …………………… .….. …… 21 2 4. b. Auxin transport and act ion are required for microspore embryogenesis i nitiation and progression …………… ………. 21 3 5. KEY FACTORS INVOLVED IN MICROSPORE EMBRYOGENESIS ARE COMMON AND INDEPENDENT OF THE INDUCTOR STRESS AND THE SPECIES ………………… 21 5 CONCLUSIONS ………………………………… ………………………... 221 REFERENCES ………………………………………………… ………….. 22 5 RESUMEN/ABSTRACT RESUMEN/ ABSTRACT 2 RESUMEN/ ABSTRACT RESUMEN FACTORES CLAVE IMPLICADOS EN LA EMBRIOGÉNESIS DE MICROSPORAS INDUCIDA POR ESTRÉS EN CEBADA Y COLZA: METILACIÓN DEL DNA, PROTEÍNAS DE ARABINOGALACTANOS Y AUXINA INTRODUCCIÓN La embriogénesis de microsporas es un proceso in vitro en el que la microspora o polen inmaduro, mediante la aplicación de un tratamiento de estrés se reprograma y abandona su ruta de desarrollo gametofítico para iniciar la ruta embriogénica, dando lugar a embriones y plantas haploides y doble-haploides. Este proceso es de gran interés básico y aplicado en biotecnología y mejora vegetal para la obtención rápida de nuevas variedades, sin embargo aún tiene importantes limitaciones en su explotación por su baja eficiencia en muchas especies de interés económico. La limitación en la aplicación de este proceso es debida a que los mecanismos de inducción y progresión de la embriogénesis de microsporas no están todavía completamente dilucidados. La monocotiledónea Hordeum vulgare (cebada) y la dicotiledónea Brassica napus (colza) son especies modelo para este proceso, en las cuales se induce embriogénesis directa en cultivos de microsporas aisladas en medio líquido, mediante tratamientos de estrés con diferentes temperaturas. OBJETIVOS Y RESULTADOS En esta tesis doctoral, se ha inducido la embriogénesis en cultivos de microsporas aisladas mediante tratamientos de estrés a temperaturas diferentes en las dos especies ya mencionadas, a 32ºC en colza, y a 4ºC en cebada. Estudios previos de nuestro grupo han sugerido algunos factores que podrían estar implicados en la iniciación y 3 RESUMEN/ ABSTRACT progresión de la embriogénesis de microsporas, los cuales se han estudiado en esta tesis. Se han analizado, mediante un abordaje multidisciplinar en las dos especies, cebada y colza, tres de estos factores: 1) la metilación del DNA, 2) las proteínas de arabinogalactanos (AGPs) y 3) la auxina endógena. Se han comparado los resultados