Hydroxyzimtsäureamide als Abwehrstoffe gegen Phytophthora infestans in Arabidopsis thaliana und Solanum tuberosum Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I Biowissenschaften der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg vorgelegt von Frau Diplom-Biochemikerin Melanie Dobritzsch geboren am 04.02.1983 in Leisnig Gutachter: 1. Prof. Dr. Dierk Scheel (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) 2. Prof. Dr. Ingo Heilmann (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg 3. Prof. Dr. Felix Mauch (Universität Fribourg; Schweiz) Datum der Verteidigung: 24.05.2016 Inhaltsverzeichnis i. Inhaltsverzeichnis i. Inhaltsverzeichnis .............................................................................................................................................. i ii. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................................. vi 1. Einleitung .................................................................................................................................................... 1 1.1. Solanum tuberosum ............................................................................................................................. 1 1.2. Phytophthora infestans ......................................................................................................................... 2 1.3. Pflanzliche Immunantwort ........................................................................................................... 4 Nichtwirts-Resistenz ............................................................................................................ 8 1.4. Immunabwehr an der Zellperipherie in Pflanzen ................................................................... 11 Chemische Abwehr in S. tuberosum gegen P. infestans .................................................... 16 Hydroxyzimtsäureamide .................................................................................................... 17 1.5. Acyltransferasen ............................................................................................................................ 23 BAHD-Acyltransferasen ................................................................................................... 23 GCN5-Acyltransferasen .................................................................................................... 24 1.6. Zielstellung der Arbeit ................................................................................................................. 26 Pflanzen ............................................................................................................................... 27 Pathogen .............................................................................................................................. 27 Bakterien .............................................................................................................................. 28 Chemikalien ......................................................................................................................... 28 Medien ................................................................................................................................. 28 Nukleinsäuren-Isolierungen .............................................................................................. 30 Southern-Blot für Southernhybridisierung ..................................................................... 31 Northern-Blot für Northernhybridisierung ................................................................... 32 Herstellung radioaktiv markierter Sonden und Hybridisierung .................................. 32 Waschen der Nylonmembran und Storage Phospo-Screen – Analyse ........................ 32 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ................................................................................ 32 Restriktionsverdau .............................................................................................................. 34 Kreuzung der Arabidopsis thaliana-Mutanten pen2 und mate1 ....................................... 34 Genotypisierung von Arabidopsis thaliana-Mutanten ..................................................... 35 Klonierungen ...................................................................................................................... 35 Transformation von kompetenten A. tumefaciens AGL-0-Zellen ................................ 39 i i. Inhaltsverzeichnis Plasmid-DNA-Isolierung aus A. tumefaciens ................................................................... 39 Stabile Transformation von Kartoffelpflanzen mit A. tumefaciens .............................. 40 Transiente Transformation von Tabakpflanzen mit A. tumefaciens ............................. 41 Transformation von Arabidopsis-Protoplasten ............................................................. 41 Konfokale Laserscan-Mikroskopie .................................................................................. 41 Zoosporengewinnung von P. infestans ............................................................................. 41 Gewinnung von P.-infestans-Sporangien .......................................................................... 42 Kulturführung der Kartoffel-Meristem-Sterilkultur ..................................................... 42 Probennahme für LC/MS/MS-Messungen von A. thaliana ........................................ 42 Probennahme für LC/MS/MS-Messungen von S. tuberosum ...................................... 43 LC/MS/MS-Messungen ................................................................................................... 43 Identifizierung von Metaboliten ...................................................................................... 45 Relative Quantifizierung von P.-infestans-Biomasse ....................................................... 47 In vitro-Inhibierungsassay von p-Cumaroylagmatin auf P.-infestans- Myzelwachstum ... 47 P.-infestans-Zoosporen Inhibierungs-Assay ..................................................................... 48 2.3. Statistische Signifikanzberechnungen von Messwerten ......................................................... 48 3. Ergebnisse ................................................................................................................................................ 50 3.1. Expression von AtACT1 und AtMATE in A. thaliana ......................................................... 50 3.2. Subzelluläre Lokalisation von AtACT1 in A. thaliana ............................................................ 51 Transiente AtACT1-YFP Expression in Nicotiana benthamiana ................................... 51 Transiente AtACT1-YFP Expression in Zellkulturprotoplasten ............................... 52 3.3. Charakterisierung von AtACT1- und AtMATE-knock out-Linien ...................................... 53 p-Cumaroylagmatingehalte in Blättern von A.–thaliana-knock-out-Linien ................... 54 p-Cumaroylagmatingehalte in Tropfen von A.-thaliana-knock-out-Linien ................... 56 3.4. Die Rolle von p-Cumaroylagmatin in der Abwehr gegen P. infestans .................................. 60 In-vitro-Inhibierungstest von p-Cumaroylagmatin auf das Myzelwachstum von P. infestans 60 In-vitro-Inhibierungstest von p-Cumaroylagmatin auf die Zoosporenkeimung von P. infestans 61 In-vitro-Inhibierungstest von Inokulierungstropfen auf das Myzelwachstum von P. infestans 62 In-vitro-Inhibierungstest von Inokulierungstropfen auf die Zoosporenkeimung von P. infestans ............................................................................................................................................ 64 ii i. Inhaltsverzeichnis 3.5. Vergleich p-Cumaroylagmatingehalte in S. tuberosum (Wildtyp) und A. thaliana (Wildtyp) 65 3.6. Transgene Expression von AtACT1 in Kartoffel .................................................................. 66 Überprüfung auf T-DNA-Einbau von AtACT1 exprimierenden transgenen Kartoffellinien .................................................................................................................................... 66 Nachweis der Expression von AtACT1-Transkript in transgenen Kartoffellinien . 67 Nachweis von AtACT1 in transgenen Kartoffellinien per qRT-PCR ....................... 68 3.7. Veränderte HCAA-Gehalte in transgenen AtACT1 exprimierenden Kartoffellinien ... 69 3.8. Gehalt an sezerniertem p-Cumaroylagmatin in transgenen AtACT1 exprimierenden Kartoffellinien ............................................................................................................................................... 72 p-Cumaroylagmatin in Blättern von transgenen AtACT1-exprimierenden Kartoffellinien .................................................................................................................................... 72 p-Cumaroylagmatin in Tropfen auf transgenen AtACT1 exprimierenden Kartoffellinien .................................................................................................................................... 73 3.9. Transgene Expression von AtACT1-AtMATE in Kartoffel ............................................... 75 Expression von AtACT1-AtMATE in transgenen Kartoffellinien ........................... 76 3.10. Morphologischer Phänotyp der transgenen p35S-AtACT1-p35S-AtMATE exprimierenden Kartoffellinien .................................................................................................................