UNIVERSIDADE DE LISBOA Faculdade de Farmácia Gene-targeted strategies to eliminate HIV latent cells through synthetic activators and suicide lentivectors Pedro Ricardo Lucas Perdigão Orientadores: Prof. Doutor João Manuel Braz Gonçalves Doutora Mariana Canelhas Palminha Santa-Marta Tese especialmente elaborada para obtenção do grau de Doutor em Farmácia, especialidade Biotecnologia Farmacêutica. 2017 UNIVERSIDADE DE LISBOA Faculdade de Farmácia Gene-targeted strategies to eliminate HIV latent cells through synthetic activators and suicide lentivectors Pedro Ricardo Lucas Perdigão Orientadores: Prof. Doutor João Manuel Braz Gonçalves Doutora Mariana Canelhas Palminha Santa-Marta Tese especialmente elaborada para obtenção do grau de Doutor em Farmácia, especialidade Biotecnologia Farmacêutica. Júri: Presidente: Doutora Matilde da Luz dos Santos Duque da Fonseca e Castro, Professora Catedrática e Diretora da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Vogais: - Doutor Manuel António Faria Viola Gonçalves, Associate Professor Leiden University Medical Center, The Netherlands; - Doutor Luís Fernando Morgado Pereira Almeida, Professor Auxiliar Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; - Doutor Nuno Eduardo Moura dos Santos da Costa Taveira, Professor Catedrático Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz; - Doutora Ana Cristina Gomes Espada de Sousa, Investigadora Coordenadora Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa; - Doutor José António Frazão Moniz Pereira, Professor Catedrático Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa; - Doutor João Manuel Braz Gonçalves, Professor Associado com Agregação Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, Orientador. Fundação para a Ciência e Tecnologia – Ministério da Educação e Ciência: SFRH/BD/81941/2011 2017 Pedro Ricardo Lucas Perdigão was financially supported by a PhD fellowship (SFRH/BD/81941/2011) from Fundação para a Ciência e a Tecnologia—Ministério da Educação e Ciência (FCT-MEC), Portugal. This work was supported by grants from Alto Comissariado para a Saúde and Fundação para a Ciência e Tecnologia - Ministério da Educação e Ciência (FCT-MEC) (VIH/SAU/0013/2011, VIH/SAU/0020/2011 and HIVERA/0002/2013), The Skaggs Institute for Chemical Biology and the National Institutes of Health (DP1CA174426) and Bill and Melinda Gates Foundation (Grand Challenges Explorations Round 7). The research described in the present thesis was performed from January 2012 until March 2017 under the supervision of Professor João Gonçalves and Dr. Mariana-Santa-Marta at the URIA- Unidade de Retrovírus e Infeções Associadas and Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa) of the Faculty of Pharmacy, University of Lisbon, Lisbon, Portugal. This project was also performed in collaboration with Professor Carlos F. Barbas III from the The Skaggs Institute for Chemical Biology and Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology of The Scripps Research Institute, La Jolla, California, United States of America. The results described in this thesis were included in manuscripts already published or in preparation, in peer-reviewed journals and oral or poster communications of international and national scientific meetings: Articles in peer review journals Perdigão P, Cunha-Santos C, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Short-term protein delivery of cell-penetrating zinc-finger activators stimulate latent HIV-1 expression. Manuscript in preparation. Perdigão P, Gaj T, Santa-Marta M, Barbas III C, Gonçalves J (2016). Reactivation of latent HIV-1 expression by engineered TALE transcription factors. Plos One, 2;11(3):e0150037. Oral communications Perdigão P, Gaj T, Rocha C, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Gene-therapeutic approach complementing TALE activators and suicidal vectors target and eliminate HIV latent cells. 8th iMed.UL Postgraduate Students Meeting 2016, Lisboa, Portugal, OC11, pp 12. Perdigão P, Gaj T, Rocha C, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Gene-therapeutic approach complementing TALE activators and suicidal vectors target and eliminate HIV latent cells. FASEB Science Research Conference: Genome Engineering - Cutting-Edge Research and Applications 2016, Lisbon, Portugal. Perdigão P, Gaj T, Rocha C, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Specific elimination of latent HIV infected cells through a “shock and kill” suicidal gene therapy. 8th Biennal Congress of the Spanish Society of Gene and Cell Therapy 2015, San Sebastian, Spain. Posters in conferences Perdigão P, Gaj T, Rocha C, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Gene-therapeutic approach complementing TALE activators and suicidal vectors target and eliminate HIV latent cells. FASEB Science Research Conference: Genome Engineering - Cutting-Edge Research and Applications 2016, Lisbon, Portugal. Perdigão P, Gaj T, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Reactivation of latent HIV-1 expression by engineered TALE transcription factors. ESGCT and FSGT Collaborative Congress 2015, Helsinki, Finland. Perdigão P, Gaj T, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Reactivation of latent HIV-1 expression by engineered TALE transcription factors. 7th iMed.UL Postgraduate Students Meeting 2015, Lisboa, Portugal. Perdigão P, Gaj T, Barbas III C, Santa-Marta M, Gonçalves J. Engineered artificial transcription factors as novel tools to eliminate HIV latency. 6th iMed.UL Postgraduate Students Meeting 2014, Lisboa, Portugal. Perdigão P, Santa-Marta M, Gonçalves J. Specific elimination of HIV-1 infected cells using a Tat/Rev-dependent circuit, A Collaborative Solution for Tropical Diseases: The Luso- American Response. Conference on HIV/AIDS research 2011, Lisboa, Portugal. Agradecimentos AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, quero agradecer aos meus orientadores. Ao Professor Doutor João Gonçalves por me receber no seu laboratório, por me ter introduzido nesta área tão fascinante da terapia génica e engenharia do genoma, pela sua orientação ao longo deste trabalho, pela confiança que teve em mim e pelo incentivo. À Doutora Mariana Santa-Marta pela orientação, paciência e acompanhamento desde o início da minha carreira como investigador, por todos os conhecimentos e conselhos transmitidos, e por todo o apoio dado não só no trabalho, mas também a nível pessoal. Gostaria de agradecer também ao Professor Doutor Moniz-Pereira, por me ter acolhido no seu departamento. Quero também fazer um agradecimento especial ao falecido Professor Doutor Carlos Barbas, por me ter aceite no seu laboratório no Instituto Scripps. A sua morte foi também uma grande perda para a comunidade científica que ficou privada de um brilhante investigador que ainda tinha tanto para oferecer. Infelizmente não pude interagir diretamente consigo e aprender com a sua experiência, no entanto disponibilizou todos os meios e conhecimentos do seu laboratório e como tal teve um enorme contributo para a conclusão deste trabalho. Obrigado! Quero agradecer aos meus colegas do JG lab que se cruzaram comigo durante o meu percurso. Obrigado Catarina (companheira em todos os momentos), Soraia, Cátia e Ana Catarina pela vossa amizade, apoio e companhia ao longo de todos estes anos. Obrigado Paula, Luís, Vasco, Lídia, Andreia, Acilino, Inês, Sofia Romano, Cheila, Renato, Sofia Cerqueira, Joana, Sofia Narciso, Sylvie, Rita e André (espero não me esquecer de ninguém). Todos contribuíram de alguma forma para meu percurso. Obrigado por toda a disponibilidade dada e paciência que tiveram para me transmitir conhecimentos ou pelos momentos de companheirismo e descontração que ajudam a ultrapassar os dias mais difíceis. Obrigado Catarina e Cheila pela vossa participação direta neste trabalho. Obrigado também aos membros do laboratório do Professor Nuno Taveira e Professora Cecília Rodrigues, pela amizade e partilha de conhecimento e reagentes. Obrigado ao Professor João Barata por disponibilizar o seu laboratório para experiências. I would like to thank the members of the Barbas lab, for taking me in and for your support and friendship. You were essential for my integration into your group. I would like to thank Dr. Joel Gottesfeld for taking the role of Dr. Barbas and supervising my work during our labmeetings, for your mentorship as well for your sympathy. Thank you, Roberta and Mishelle i Agradecimentos for your efforts to keep the lab running and organized, and for providing me with all the conditions that I could wish for to carry out my projects. Thank you, Thom, for your friendship and for your help and advice that helped me grow as a researcher. Thank you, Jia, for sharing your knowledge as well and for your support. Thanks Shannon and Mike Z. for all the good times. I miss you all and hope to see you again! Thank you, Brian, Klaus, Mark, Wei, Robyn, James and all the remaining members of the lab for your assistance and friendship. Finally, I would also like to thank to the ones that took me into their houses and shared their lives during my stay at San Diego, John, Paul, Fred, Aaron and Patrick. Thank you all! Aos meus amigos, pelos momentos de diversão que sempre conseguiram colocar um sorriso na minha cara, mesmo nos momentos mais complicados. Obrigado por todo o incentivo! Quero agradecer à minha família, aos meus pais por todo o amor e compreensão. Obrigado por acreditarem sempre em mim e no meu percurso. Sei que têm orgulho em mim e sempre me esforcei para corresponder o melhor possível a toda a educação e apoio que me deram. Ao meu irmão, por ser sempre um exemplo e me incentivar a ser melhor. À minha cunhada, por todo apoio dado e pela