UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA Copy number variation and Huntington’s disease Angelica Vittori Ramo das Ciências Biomédicas Especialidade – Neurociências Outubro 2013 UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA Copy number variation and Huntington’s disease Candidata: Angelica Vittori Orientadores: Prof . Doutor Tiago Fleming Outeiro Doutor Flaviano Giorgini Doutor Edward J. Hollox Ramo das Ciências Biomédicas Especialidade – Neurociências Todas as afirmações efectuadas no presente documento são da exclusiva II responsabilidade do seu autor, não cabendo qualquer responsabilidade à faculdade de medicina de lisboa pelos conteúdos nela apresentados. A impressão são da exclusiva está dissertação foi aprovada pelo Conselho Cientifico da Faculdade de Medicina em reunião de 19 de Novembro de 2013. III Resumo A variação de número de cópias (CNV em inglês) é uma modificação de uma sequência de DNA que apresenta uma inserção ou deleção em comparação com um genoma de referência com um número de cópias de N = 2. Com um comprimento variável, desde 50 pares de bases até várias megabases, as CNVs identificadas têm um tamanho médio de ~ 3 Kb e representam cerca de 4% do genoma humano. As CNVs, como outras variações genéticas, podem afetar directamente os níveis de expressão dos genes afectados. Os efeitos indirectos na expressão genética podem ser causados por alterações da posição, interrompendo o quadro de leitura do gene ou posteriormente, perturbando as redes de regulação genética. Foi demonstrado que as CNVs são em grande parte responsáveis pela evolução humana e diversidade genética entre os indivíduos. A relevância das CNVs no genoma humano foi salientada por vários estudos de associação que mostraram o efeito das CNVs na susceptibilidade a doenças neurodegenerativas, doenças de características complexas, e por serem a principal causa do aparecimento de doenças mendelianas ou por conferirem um fenótipo benigno. A doença de Huntington (DH) é uma doença degenerativa e progressiva do cérebro que é fatal. Clínicamente é caracterizada por disfunção motora, distúrbios emocionais / psiquiátricos graves, declínio cognitivo e demência. A DH é monogénica e autossómica dominante, sendo causada por uma expansão anormal do trinucleótido citosina-adenina- guanina (CAG) no terminal 5' do gene da Huntingtina (HTT), localizado no cromossoma 4. Normalmente, a manifestação dos sintomas da doença dá-se por volta dos 40 anos, mas formas mais precoces (início <20 anos) e mais tardias (> 70 anos) também existem. O comprimento da expansão aberrante da repetição CAG no gene HTT está inversamente correlacionado com a idade de ocorrência (IO) da doença. O comprimento desta repetição explica ~ 50-70% na variação da IO sendo o restante da variação explicado por outros fatores genéticos e ambientais. Vários estudos têm como objectivo identificar modificadores genéticos da IO em DH, ou seja, nomeadamente um gene que quando IV mutado tem a sua função alterada e determina o aparecimento do fenótipo associado com a mutação CAG. Há poucos modificadores genéticos identificados através de abordagens multi-translacionais de grandes estudos de coorte da doença para validação em vários modelos experimentais, representando, no entanto uma abordagem válida para identificar novos alvos terapêuticos para a DH. O nosso objetivo neste estudo foi identificar genes candidatos com variação de número de cópias com potencial para modificar a IO na DH. Após a triagem de uma biblioteca de CNVs a partir de análise de dados matriz-CGH (disponível em linha através do navegador genoma UCSC), foram seleccionados vários candidatos: a região da β-defensine (DEFB4) e o transportador de glicose neuronal 3 (SLC2A3). Colocámos a hipótese de que a CNV na região de β-defensine (que varia de 2 a 8 cópias) poderia afectar o início da DH através de uma expressão variável do gene DEFB4 (presente nesta região) que codifica para um péptido antimicrobiano importante. Um aumento do número de cópias, codificantes para um nível mais elevado de proteína, podem contribuir a inflamação neuronal presente na DH e consequentemente piorando a evolução da doença. Assim, investigámos o papel potencial da CNV do gene SLC2A3 (que variam de 1 a 3 cópias), assumindo que o maior número de cópias pode ser protector na DH, codificando para um nível mais elevado do transportador de glicólise (GLUT3). Analisámos a distribuição das CNVs dos nossos genes candidatos em indivíduos do estudo REGISTRY realizado pela Grupo Europeu da Doença de Huntington (EHDN), utilizando o Teste da Razão de Parálogos (PRT). PRT é uma tipagem de elevada capacidade de variação do número de cópias que se baseia em PCR quantitativo e relativo. Determinámos o número de cópias da β-defensine em 490 indivíduos da nossa coorte de DH. A distribuição de CNVs de β-defensine nesta coorte não é significativamente diferente da população europeia sem DH (valor de p= 0,91) e também não está associada a uma alteração significativa da IO (valor de p = 0,41). Assim, podemos concluir que a CNV de β-defensine não é relevante na patologia da DH durante a fase inicial da progressão da doença. No entanto, com o nosso estudo, não podemos descartar qualquer papel potencial do gene DEFB4 numa outra fase da doença. V Determinámos depois a distribuição de CNVs no gene SLC2A3 em 988 indivíduos com a DH e não foi significativamente diferente da população britânica (valor de p =0.38). Curiosamente, verificou-se uma associação significativa entre a CNV de SLC2A3 e uma variação de IO na nossa coorte de DH (valor de p = 0,028). Indivíduos com três cópias de SLC2A3 mostraram um atraso do IO em comparação com o resto do grupo de até cerca de 6 anos. De modo a investigar a base molecular deste efeito protector da GLUT3 analisámos os níveis de expressão da proteína em linhas linfocíticas imortalizadas obtidas a partir de pacientes da nossa coorte, portadores de 1, 2 e 3 cópias de SLC2A3 (5 por cada genótipo). Pela análise immunoblot detectou-se que um maior número de cópias no gene SLC2A3 está associado a um maior nível de expressão da proteína (valor de p = 0,02). Assim, o efeito protector do aumento do número de cópias de SLC2A3 é devido a uma maior expressão do transportador de glicose. Para investigar a base funcional deste efeito protector, foi utilizado um modelo de Drosophila de DH para estudar o efeito de sobre-ou sub-expressão do funcional homólogo de SLC2A3 em Drosophila, Glut1. Analisámos vários indicadores relevantes da doença, incluindo a neurodegeneração dos fotorreceptores, longevidade e taxa de eclosão. Descobrimos que em moscas com DH a sobreexpressão de Glut1 pode reduzir significativamente a perda de rhabdomeres e portanto a neurodegeneração (valor de p <0,001). Pelo contrário, a redução ou a alteração génica deste transportador estão associados com um pior cenário que se manifesta por uma perda maior de rhabdomeres (valor de p = 0,00012 *), uma redução da longevidade média (valor de p = 0,034) e uma redução da taxa de eclosão (valor de p = 0,015). Alterações do principal transportador de glicose num modelo de Drosophila da DH agrava a progressão da doença numa fase inicial, e sobrerexpressão deste transportador protege da neurodegeneração na mosca adulta, confirmando os resultados na coorte de DH. Do que sabemos, este é o primeiro estudo que investigou a função potencial das CNVs em DH. Conclui-se que a CNV no gene SLC2A3 é um novo modificador genético do IO em grandes coortes de DH (988 amostras), em que un aumento de cópias do gene está associado a um efeito protector na DH. Testámos o efeito molecular da ocorrência desta CNV em linhas celulares obtidas directamente dos pacientes e descobrimos que o evento de VI CNV do gene é responsável por um aumento da expressão de GLUT3 na DH, o que poderá repor a deficiência energética nos neurônios de pacientes com a DH e atrasar a neurodegeneração. Além disso, usámos um modelo de Drosophila de DH para testar a função funcional da homólogo de SLC2A3 em moscas (Glut1), confirmando que uma sobre- expressão deste transportador pode diminuir a progressão da doença na mosca adulta, e a alteração do gene piora a progressão da doença num estadio inicial. É necessária futura investigação para reproduzir esta observação e confirmar o SLC2A3 como um alvo de potencial terapeutico para o tratamento da DH. * os dados referem-se a moscas no dia 1 pós eclosão. Palavras-chave: variação do número de cópia (CNV), doença de Huntington (DH), modificadores genéticos, DEFB4, SLC2A3, Drosophila. VII Index RESUMO ...................................................................................................................................IV INDEX .....................................................................................................................................VIII INDEX OF THE FIGURES .................................................................................................................. X INDEX OF THE TABLES .................................................................................................................. XII ABBREVIATIONS ....................................................................................................................... XIV ABSTRACT ............................................................................................................................. XVII CHAPTER ONE: INTRODUCTION .................................................................... 1 1.1 COPY NUMBER VARIATION .....................................................................................................